0034-7515

S0034-75151997000300002

Cuba

00 12 1997

31 3 155 158

Optimización del juego de reactivos para la determinación de urea en suero. Método Berthelot modificado Mariela G. Sijó Yero,¹ Lilliam Valdés Diez,²Ángela González García³ y Yaimí Farias Domínguez⁴

1 Licenciada en Ciencias Farmacéuticas. Aspirante Investigadora.
² Licenciada en Química. Investigadora Auxiliar.
3 Licencia en Bioquímica.
4 Licenciada en Matemáticas.

RESUMEN

Se desarrolló el proceso de optimización en una técnica de análisis y una formulación, basado en el método Berthelot modificado con salicilato de sodio, el cual se diseñó para la determinación de dicho analito en suero. Los objetivos evaluados fueron: solución reactivo color, solución reactivo alcalino, temperatura de reacción, tiempo de desarrollo del color, tiempo de hidrólisis, actividad enzimática de la ureasa y longitud de onda. Se establecieron los valores óptimos de cada uno de los parámetros analizados; se logró linealidad en un rango de concentraciones de urea desde 3,33 hasta 26,6 mmol/L y se realizó un estudio de precisión donde se obtuvo un coeficiente de variación de 4,8 %.

Descriptores DeCS: JUEGO DE REACTIVOS PARA DIAGNOSTICO/normas; UREA/sangre; EFECTIVIDAD.

Entre las funciones metabólicas del hígado se incluyen la participación importante de este órgano en diversas vías metabólicas de síntesis, degradación y destoxificación; lo que justifica que la enfermedad hepática ocasione anomalías de una enorme cantidad de sustancias, como la urea, presentes en la sangre, orina u otros líquidos orgánicos.¹

Existen diferentes técnicas para la determinación de urea en suero, siendo un clásico el método de Berthelot.² Basados en una modificación de éste, Tabbaco y otros³ plantean el uso de sólo 2 reactivos: un reactivo enzimático o color y un reactivo alcalino.

Es de gran importancia la estabilidad de la enzima en la determinación; por ello Cam, Barrier y Lawny⁴ estudian una selección de derivados fenólicos (componente del reactivo color), capaces de formar un reactivo estable con la ureasa y su aplicación en química clínica.

En estudios previos, realizados en la Empresa de Productos Biológicos "Carlos J. Finlay" titulados Variantes del método de Berthelot y Juego de reactivos para la determinación de urea en suero, se demuestra que la mejor variante es Berthelot modificado con salicilato de sodio, lo que constituye el fundamento del juego de reactivos objeto de estudio en el presente trabajo. ]]> Se realiza la optimización mediante el uso de diversos diseños matemáticos,^5,6 que permiten viabilizar las rutas experimentales; el proceso de optimización es uno de los aspectos más importantes a desarrollar en el diseño de la obtención de un diagnosticador.

MÉTODOS

Solución reactivo color y solución reactivo alcalino. Se realizaron varios ensayos en solución de referencia de urea para analizar la concentración de salicilato de sodio, evaluándose 42 y 62 mmol/L con 10 determinaciones en cada caso. Seguidamente se efectuó el procesamiento estadístico de los resultados mediante el método ANOVA-1.

Para el análisis de la combinación hipoclorito de sodio-hidróxido de sodio se ensayaron 4 variantes: 1,0 mM- 0,043 M; 1,0 mM-0,123 M; 6,5 mM-0,043 M y 6,5 mM - 0,123 M, y se elaboró un diseño factorial 3² que propuso otras 9 combinaciones: 3,75 mM-0,083 M; 6,5 mM-0,083 M; 9,25 mM-0,083 M; 3,75 mM-0,123 M; 6,5 mM-0,123 M; 9,25 mM-0,123 M; 3,75 mM-0,163 M; 6,5 mM-0,163 M y 9,25 mM-0,163 M. Posteriormente se realizó una regresión cuadrática de donde se obtuvieron 3 nuevas variantes: 2,01 mM-0,1285 M; 4,6 mM-0,1121 M y 7,15 mM-0,1464 M, que fueron evaluadas en 4 condiciones de reacción: solución de urea (A: ensayos sin agua y B: con agua destilada); y solución de sulfato de amonio (C: ensayos sin agua y D: con agua destilada); se realizaron 5 determinaciones en cada caso. Fue seleccionada la absorbancia como variable respuesta, cuya medida nos permitió definir la combinación óptima de concentraciones.

Temperatura de reacción. Se desarrollaron ensayos en suero control externo de producción nacional, lote 3002, a 25, 30 y 37 EC, con 5 determinaciones cada uno.

Tiempo de desarrollo del color. Se utilizó una solución de sulfato de amonio 5 mmol/L, para desarrollar la técnica con variaciones del tiempo de reacción de 5, 10, 15, 20, 30 y 60 min, con 5 determinaciones en cada ensayo.

Tiempo de hidrólisis. En una solución de referencia de urea se realizaron varios ensayos de 5 determinaciones, fijando 5 min de desarrollo del color y variando el tiempo de hidrólisis desde los 3 hasta los 15 min.

Actividad enzimática. Se desarrolló la técnica analítica en solución de urea 5 mmol/L; el valor de la actividad enzimática varió desde 2,51 hasta 22,0 U/mL, con 5 determinaciones en cada uno de ellos. Se utilizó 5 min de hidrólisis y 5 de desarrollo del color.

Longitud de onda. Se estudió el rango de 580 a 620 nm con un juego de soluciones de referencia de urea comercial (Boehringer Mannheim). Se desarrolló una curva de calibración por triplicado a cada longitud de onda analizada.

Análisis de imprecisión. Con la nueva formulación y la técnica analítica optimizada, se evaluaron 80 muestras de suero control externo, lote 4004. Se calculó el coeficiente de variación entre los valores obtenidos en el día para conocer la repetibilidad y entre las corridas para determinar la reproducibilidad.

Todos los resultados fueron procesados estadísticamente mediante el método de clasificación simple ANOVA-1.

RESULTADOS

Los valores obtenidos de absorbancia y del estadígrafo F en cada ensayo, se muestran en la tabla 1. TABLA 1. Optimización de la concentración de salicilato de sodio ]]>

Ensayos	1	2	3	4	5	6	7
Absorbancia 42 mM	0,108	0,102	]]> 0,130	0,105	0,056	0,117	0,154
62 mM	0,112	0,101	0,132	0,097	0,065	]]> 0,103	0,152
F	0,787^*	0,030^*	0,394^*	4,609^*	2,219^*	5,297^*	0,360^*

* NS ]]> Como resultado de la regresión cuadrática, se propusieron 3 variantes para el reactivo alcalino y se realizaron 4 ensayos (A, B, C, D) con cada uno (tabla 2, figura 1). TABLA 2. Optimización del reactivo alcalino

			Ensayos
	Hipoclorito de sodio	Hidróxido de sodio	A	B	C	D
Variante	]]> (mmol/L)	(mol/L)	(Valores de absorbancia)
1	2,01	0,1285	0,099	0,051	0,149	0,102
2	4,6	]]> 0,1121	0,172	0,115	0,176	0,116
3	7,15	0,1464	0,163	0,104	0,143	]]> 0,102

FIGURA 1. Optimización del reactivo alcalino.

En relación con el tiempo de desarrollo del color, los valores registrados en los diferentes tiempos evaluados fueron:

Tiempo (min)	Absorvancia
5	0,158
10	0,159
15	0,161
20	0,162
30	]]> 0,165
60	0,168
F	1,368 (NS)

En cuanto al tiempo de hidrólisis los ensayos dieron los resultados siguientes:

Tiempo (min)	Absorbancia
3	0,147
5	0,143
]]> 10	0,148
15	0,141
F	0,521 (NS)

Con respecto a la temperatura de reacción los valores obtenidos fueron:

Temperatura de los tiempos de hidrólisis y reacción (5 min)	Absorbancia
25 EC	0,128
30 EC	0,137
37 EC	]]> 0,134
F	0,494 (NS)

La optimización de la actividad enzimática se muestra en la figura 2.

FIGURA 2. Optimización de la actividad enzimática.

El estudio de la longitud de onda reportó coeficientes de correlación de 0,998850, 0,999953 y 0,999871 en curvas de calibración a 580, 600 y 620 nm respectivamente (figura 3).

FIGURA 3. Optimización de la longitud de onda.

Los coeficientes de variación obtenidos en el estudio de imprecisión fueron:

Días	]]> CV(%)
1	0,44
2	1,89
3	2,37
4	4,89
5	]]> 0,73
6	0,91
7	1,24
8	2,19
Entre series	4,80

DISCUSIÓN

La optimización de las concentraciones de los componentes de un medio diagnóstico va aparejada a muchos ensayos que nos den la combinación más adecuada, con el propósito de que el producto en estudio proporcione valores más confiables al introducirse en el diagnóstico clínico.

En un sistema, donde las concentraciones de los componentes interactúan entre sí para dar una mejor respuesta, el desarrollo de un estudio combinado es imprescindible ya que se pueden analizar diferentes variables de forma simultánea, lo que hace posible determinar cómo influye la concentración de cada componente y definir a su vez los valores de la variante óptima. Haciendo uso de los diseños estadísticos establecidos, se realizaron determinaciones que es el mínimo posible para lograr este objetivo, lo que representó un valioso ahorro en tiempo de análisis, materiales, materia prima y otros. ]]> Se evaluó 42 y 62 mmol/L de salicilato de sodio, ya que constituyen los límites extremos de un rango que abarca otras propuestas de concentración, según la literatura consultada para este componente. Como resultado de los procesamientos anteriores se concluyó que la concentración óptima de salicilato de sodio es de 42 mmol/L; 4,6 mmol/L de hipoclorito de sodio y 0,1121 mol/L de hidróxido de sodio. De igual forma se obtuvo un rango óptimo de actividad de ureasa comprendido de 4,6-10,35 U/mL y garantizar así la hidrólisis completa del analito.

Después de obtenido el diseño del diagnosticador, fue imprescindible optimizar la condiciones de reacción.

En relación con la temperatura, el resultado del estudio nos posibilitó adaptar la técnica a las diversas condiciones instaladas en los laboratorios.

Al evaluar los resultados del tiempo de desarrollo del color, pudimos disminuirlo hasta 5 min, de manera que se logró incrementar el número de ensayos a realizar, que conjuntamente con la optimización del tiempo de hidrólisis nos permitió introducir esta técnica tanto para uso manual como automatizado, y así darle mayor flexibilidad al sistema; quedó establecido un máximo de absorción a 620 nm.

La evaluación final del sistema optimizado se analizó mediante su funcionabilidad, ya que su introducción en la labor diaria del laboratorio debe estar avalada por un elevado grado de confiabilidad y seguridad en los resultados que con él se van a obtener.

Los resultados de linealidad (r: 0,999871) y de imprecisión (CV = 4,8 %), dieron un buen criterio del comportamiento del producto.

SUMMARY

The process of optimization was developed in a technique of analysis and in one formulation based on the Berthelot method modified with sodium salicilate, which was designed for the determination of such analyte in serum. The objectives evaluated were the following: color reactive solution, alkaline reactive solution, reaction temperature, color development time, hydrolisis time, enzimatic activity of urease, and wave lenght. The optimal values of each of these parameters were established. Lineality was attained in a range of urea concentrations from 3.33 to 26.6 mmo/L. A variation coefficient of 4.8 % was obtained in an accuracy study.

Subject headings: REAGENT KITS, DIAGNOSTIC/standards; UREA/blood; EFFECTIVENESS.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Cam G, Barrier IL, Lawny F. Selection of phenolic derivates capable of forming a stable mixture with urease in an aqueous solution and its use in a urea determination. French patent 2,544,742. 1984 Oct 26.
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Recibido: 23 de mayo de 1997. Aprobado: 26 de junio de 1997.

Lic. Mariela G. Sijó Yero. Empresa de Productos Biológicos "Carlos J. Finlay". Infanta No. 1162, municipio Centro Habana, Ciudad de La Habana, Cuba. ]]> 1980 1013-14 1983 19 1 1 55-61 1979 25 336-7 1984 O ct 1985 256-75 1964 176-80,308-17