Evaluación de reactivos cubanos elaborados para el diagnóstico rápido de Haemophilus influenzae tipo B

Gilda Toraño Peraza,¹ Isis Tamargo Martínez,² Rosabel Falcón Márquez,³ Kiomy Fuentes Gort,⁴ Miriam Pérez Monrás⁵ y Liset Sánchez Valdés⁶

Resumen

Se probaron en la detección del antígeno capsular específico de haemophilus influenzae tipo b (Hib), un reactivo de látex y un antisuero para contrainmunoelectroforesis (CIE) e hinchazón capsular (HC), producidos en el Laboratorio de Infecciones Respiratorias Agudas Bacterianas del Instituto «Pedro Kourí». Se evaluaron los reactivos en el serotipaje de 786 cepas de Haemophilus influenzae aisladas de procesos invasivos y de portadores nasofaríngeos, y en el diagnóstico rápido a partir de muestras de líquido cefalorraquídeo, suero y orina de 258 pacientes con diagnóstico clínico de meningoencefalitis. Se obtuvieron satisfactorios índices de sensibilidad y especificidad, los que fueron determinados utilizando como referencia el antisuero para Hib comercializado por la DIFCO para la técnica de HC y CIE, y el reactivo de látex Wellcogen para el diagnóstico de Hib. Se propone la validación de ambos reactivos por parte de los organismos nacionales acreditados, para que estos puedan ser introducidos en la red cubana de salud pública.

DeCS: HAEMOPHILUS INFLUENZAE TIPO B/aislamiento & purificación; INDICADORES Y REACTIVOS; MENINGOENCEFALITIS/diagnóstico; TESTS DE FIJACION DE LATEX; CONTRAINMUNOELECTROFORESIS; INFECCIONES POR HAEMOPHILUS/diagnóstico.

Los síndromes neurológicos infeccio-sos junto a las infecciones respiratorias agudas son reconocidos como importantes causas de altas tasas de morbilidad y mortalidad, particularmente en lactantes y niños menores de 5 años de edad.^1,2 En Cuba, Haemophilus influenzae tipo b (Hib) es frecuentemente aislado de líquido cefalorraquídeo (LCR) y uno de los principales agentes responsables de las neumonías en niños pequeños, lo que constituye un importante problema de salud cuyo impacto social demanda de técnicas de diagnóstico rápido.^3,4

La contrainmunoelectroforesis (CIE), la coaglutinación (CoA) y el radioinmuno-ensayo (RI) ya habían sido descritos⁵ cuando en 1970 y 1972 aparecen los sistemas de aglutinación de látex para el diagnóstico de las meningitis producidas por Hib y Neissseria meningitidis.^6,7 Diferentes sistemas de látex para el diagnóstico de otros agentes también responsables de cuadros de meningoence-falitis fueron descritos en la misma década, para la detección de Cryptococcus neoformans y Streptococcus grupo B,^8,9 y comenzaron a aparecer en el mercado internacional juegos de reactivos de látex provenientes de diversas firmas comerciales (Wellcogen, Bactigen, Microscan, Slidex, DIFCO, Directigen), útiles en la detección de Hib, Streptococcus pneumoniae, Escherichia coli K1, Streptococcus grupo B y Neisseria meningitidis grupos A, B, Y, C y W135.¹⁰ ]]> La limitada adquisición de estos productos en Cuba debido a su elevado costo en el mercado mundial marcó pautas para el desarrollo de sistemas de diagnóstico rápido y reactivos que permitieran suplir las necesidades nacionales. En el presente trabajo evaluamos la especificidad y sensibilidad de un reactivo de látex (Lat-Haemob) y un antisuero específico (AsHib-IPK) para CIE e hinchazón capsular (HC), elaborados en el Laboratorio de Infecciones Respiratorias Agudas Bacterianas (IRAB) del Instituto "Pedro Kourí" (IPK), para el diagnóstico rápido de enfermedades invasivas causadas por Hib.

Métodos

Preparación de los extractos antigénicos de Hib. Se cultivó la cepa ATCC 10211 de Hib en caldo cerebro-corazón suplementado con 0,2 µg/mL de hemina y NAD (DIFCO) y 0,04 g/mL de glucosa (DIFCO). Luego de una incubación por 18 h a 37 °C, seguida de una inactivación con formaldehído al 0,5 % y 3 lavados con solución salina fisiológica a 3 900 x g durante 30 min a 4 °C, se obtuvo un antígeno celular cuya concentración se ajustó a 1,5 x 10⁹ células/mL. Este fue almacenado a 4 °C, en alícuotas de 1 mL, para ser utilizado posteriormente como inmunógeno.

Para la obtención del antígeno control positivo (AgHib-IPK) se emplearon las mismas condiciones de cultivo descritas anteriormente, y fue purificado el polisacárido capsular de Hib utilizando el método fenol-H₂O referido por Westphal.¹¹

Obtención del antisuero anti-Hib (AsHib-IPK). Se inmunizaron por vía endovenosa conejos albinos de 2,5 kg de peso y 3 meses de edad con el antígeno celular antes descrito, este fue suministrado cada 3 d en dosis ascendentes: 2 inmunizaciones de 0,5; 1; 1,5 y 2 mL. Los conejos fueron sacrificados cuando se observaron títulos de anticuerpos de 1:64 o más por CIE.

El antisuero fue precipitado con una solución sobresaturada de sulfato de amonio (SA) pH 7 y se centrifugó a 2 000 x g durante 30 min a 4 °C. El precipitado obtenido se resuspendió en tampón fosfato-salina pH 7,4, se sometió a una segunda precipitación con SA al 50 % de saturación y se centrifugó manteniendo las mismas condiciones antes descritas. Finalmente la fracción gammaglobulina del suero fue resuspendida en el mismo buffer para proceder a la desalinización usando una columna preempacada PD-10

(Pharmacia, Uppsala, Sweden). Se determinó la concentración de proteínas por el método de Lowry¹² y los sueros fueron almacenados a -20 °C.

El AsHib-IPK obtenido se utilizó con 3 finalidades: en la producción de un reactivo de látex, como antisuero para el diagnóstico rápido por CIE y en la técnica de HC para el serotipaje de cepas.

Preparación del reactivo de látex para el diagnóstico de Hib (Lat-Haemob). Se utilizaron partículas de poliestireno (látex) de 0,8 µ al 10 % (sigma) para ser sensibilizadas con las inmunoglobulinas obtenidas previamente, a razón de 8-9 mg de proteína por cada miligramo de látex.^6,7 Se empleó tampón glicina salina pH 8,2 para ajustar la concentración de inmunoglobulinas y látex. Se efectuó la conjugación a temperatura ambiente, con agitación constante durante los primeros 10 min, y seguidamente se incubó durante 1 h a 37 °C, sin agitación. Se añadió albúmina de suero bovino (BSA) al 10 % (sigma) como agente estabilizador del acople (12 µL de BSA por cada 25 µL de látex al 10 %) y timerosal a una concentración de 200 µg/mL de látex sensibilizado, como preservativo. Se conservó el reactivo Lat-Haemob a 4 °C durante 12 h para proceder a su comprobación con el AgHib-IPK y el antígeno control positivo del reactivo de látex comercial Wellcogen Hib y con los controles negativos (tampón glicina salina pH 8,2 y salina fisiológica). ]]> Evaluación de la especificidad y sensibilidad del Lat-Haemob y AsHib-IPK en el serotipaje de cepas de Hi. Se incluyeron en este estudio un total de 786 cepas de Haemophilus influenzae (Hi), de las cuales 600 cepas fueron recibidas en el Laboratorio IRAB del IPK procedentes de los diferentes Centros Provinciales de Higiene y Epidemiología (CPHE) y hospitales pediátricos de todo el país,

durante los años 1990-95. Estas cepas habían sido aisladas a partir LCR y hemocultivos obtenidos de procesos invasivos en niños menores de 5 años de edad. Otras 186 cepas de Hi provenían de exudados nasales y faríngeos realizados a niños menores de 5 años de edad, que formaron parte de una investigación para la búsqueda de portadores nasofaríngeos de Hi y Streptococcus pneumoniae, realizada en el Laboratorio IRAB del IPK durante febrero y octubre de 1997 y junio de 1998.

Todas las cepas fueron previamente identificadas como Hi según la metodología internacionalmente establecida.¹³

Los resultados obtenidos en el tipaje empleando los reactivos elaborados en nuestro laboratorio fueron comparados con los obtenidos utilizando el antisuero comercializado por la DIFCO para la técnica de HC y el reactivo Wellcogen Hib para la técnica de látex.

Nuestros reactivos fueron evaluados también por CIE y látex frente a suspensiones celulares preparadas a partir de cultivos de 24 h de otros agentes bacterianos también responsables de cuadros de meningitis, cuyos antígenos polisacarídicos pueden producir falsos positivos frente a anticuerpos de Hib (Klebsiella pneumoniae, Streptococcus grupos A y B, Escherichia coli, Neisseria meningitidis y Streptococcus pneumo-niae).¹⁴ Utilizamos como controles positivos al antígeno celular de Hib empleado como inmunógeno, cuya obtención fue descrita con anterioridad, y el AgHib-IPK.

Evaluación de la especificidad y sensibilidad del Lat-Haemob y AsHib-IPK en el diagnóstico rápido. Ambos reactivos fueron utilizados en el diagnóstico de Hib mediante la detección de antígenos capsulares solubles en LCR, suero y orina, aplicando los procedimientos de aglutinación de partículas de látex y CIE. El estudio incluyó muestras de 258 pacientes menores de 5 años con diagnóstico clínico de meningoencefalitis, que fueron atendidos en los diferentes hospitales pediátricos de Ciudad de La Habana entre los años 1990-1995. Las muestras fueron tomadas el día de la admisión en el hospital y se procesaron además por la vía del diagnóstico convencional. Se emplearon simultáneamente el reactivo de látex Wellcogen para Hib y el juego de antisueros para Hi de la DIFCO.

Análisis estadísticos. Se confeccionaron las tablas de contingencia y se calcularon la sensibilidad, especificidad y los valores predictivos positivos y negativos para el Lat-Haemob y el AsHib--IPK, con el 95 % de intervalo de confianza.¹⁵ Se tomaron como referencia sus análogos comerciales, de calidad internacionalmente reconocida (As DIFCO y Latex Wellcogen).

Resultados

En la tabla 1 se muestran los resultados obtenidos con el empleo de los reactivos Lat-Haemob y AsHib-IPK en el serotipaje de las 786 cepas de Hi incluidas en nuestro estudio. La aglutinación de partículas de látex permitió el serotipaje de 599 cepas cuando se empleó el Lat-Haemob, igual resultado se observó al utilizar el látex Wellcogen. Por su parte, el AsHib-IPK permitió serotipar como Hib a 595 cepas y el antisuero para HC de la DIFCO lo hizo para 599 cepas.

Tabla 1. Resultados de la evaluación de la especificidad y sensibilidad del Lat-Haemob y el AsHib-IPK en el serotipaje de cepas de Haemophilus influenzae ]]>  

Total de cepas 786	HC		Látex
	As Hib-IPK	As DIFCO	Lat-Haemob	Látex Wellcogen
]]> A	595	599	599	599
B	191	187	]]> 187	187
Sensibilidad	99,3 %	-	100 %	-
Especificidad	]]> 100 %	-	100 %	-
VPP	100 %	-	100 %	-
]]> VPN	97,9 %	-	100 %	-

A: No. de cepas reconocidas como Hib; B: No. de cepas no reconocidas como Hib; VPP: valor predictivo positivo; VPN: valor predictivo negativo.

Al evaluar la especificidad de ambos reactivos frente a las suspensiones celulares citadas en la sección de materiales y métodos, capaces de producir falsos positivos con anticuerpos específicos para Hib, solo se observaron resultados positivos con el antígeno celular (inmunó-geno) y el AgHib-IPK utilizados como controles.

La tabla 2 resume los resultados obtenidos con el Lat-Haemob y AsHib-IPK en el diagnóstico rápido de Hib a partir de muestras clínicas. Se presentan además los resultados observados con el empleo del método convencional (cultivo). El aislamiento de Hib solo fue posible en 158 de las 258 muestras de LCR estudiadas, mientras que en un número mayor de casos se detectó antígeno capsular por medio de las técnicas de diagnóstico rápido. Nótese, que para las muestras de suero y orina, tanto por CIE como por látex, el número de casos detectados fue menor, lo que se manifestó de forma similar con el uso de los reactivos comerciales y los producidos en el Laboratorio IRAB.

Tabla 2. Resultados obtenidos en el diagnóstico rápido y convencional de Haemophilus influenzae tipo b a partir de muestras clínicas ]]>  

Diagnóstico rápido
Tipo de muestra	Cultivo	As Hib-IPK	As DIFCO	Lat-Haemob	Látex Wellcogen
]]> LCR	158	175	177	188	188
Orina	-	]]> 155	158	182	183
Suero	-	135	135	157	]]> 158

Los resultados de la evaluación de la especificidad y sensibilidad del Lat-Haemob y el AsHib-IPK en el diagnóstico rápido de Hib, a partir de las muestras de LCR, se reflejan en la tabla 3. Con el empleo del AsHib-IPK en CIE, se diagnosticaron 175 casos de meningitis como producidas por Hib, el As DIFCO detectó 2 casos más. El Lat-Haemob y el látex Wellcogen coincidieron en el número de casos diagnosticados.

Tabla 3. Resultados de la evaluación de la especificidad y sensibilidad del Lat-Haemob y el AsHib-IPK en el diagnóstico rápido de Haemophilus influenzae tipo b, a partir de muestras de LCR

 

Total de cepas 258	CIE		]]> Látex
	As Hib-IPK	As DIFCO	Lat-Haemob	Wellcogen
A	175	177	]]> 188	188
B	83	81	70	70
Sensibilidad	]]> 98,9 %	-	100 %	-
Especiicidad	100 %	-	100 %	-
]]> VPP	100 %	-	100 %	-
VPN	97,6 %	-	]]> 100 %	-

A: No. de casos de meningitis diagnosticadas como producidas por Hib; B: No. de casos de menigitis no producidas por Hib; VPP: valor predictivo positivo; VPN: valor predictivo negativo.

Discusión

La CIE y la aglutinación de partículas de látex constituyen los procedimientos más utilizados para la detección rápida de los antígenos polisacarídicos excretados a los fluidos corporales por los agentes causales más comunes de las meningoencefalitis bacterianas (MEB), pero la sensibilidad y especificidad de estos métodos depende de la calidad del antisuero utilizado.^5-7,9,16

En nuestro estudio los reactivos Lat--Haemob y AsHib-IPK fueron inicialmente utilizados para el serotipaje de 786 cepas de Hi, por las técnicas de látex e HC, respectivamente. El reactivo Lat-Haemob fue tan sensible y específico (100 %) como su análogo comercial (tabla 1).

Las 186 cepas de Hi provenientes del estudio de portadores nasofaríngeos y una cepa aislada de LCR no fueron serotipadas como Hib. Para esta última, igual resultado se obtuvo con el antisuero DIFCO por HC, y al utilizar los antisueros para otros serotipos (DIFCO) pudimos conocer que se trataba de una cepa de Hi serotipo a. Por no disponer de suficiente cantidad de tales antisueros fue imposible el serotipaje de las restantes cepas, no obstante, este resultado responde a la baja frecuencia de circulación del serotipo b entre portadores nasofaríngeos de Hi, y no a problemas de sensibilidad y especificidad de los reactivos usados. Se conoce que la mayoría de las cepas de Hi que colonizan la mucosa respiratoria son no capsuladas y que la tasa de portadores de Hib alcanza cifras de sólo 3-5 % en la niñez y del 0,4 % en adultos.¹⁷ ]]> Por su parte, el AsHib-IPK se comportó con una sensibilidad un poco menor que la de su antisuero homólogo (99,3 %), pero demostró una especificidad del 100 % en el serotipaje.

Con respecto a los resultados obtenidos durante la evaluación de los reactivos Lat-Haemob y AsHib-IPK en el diagnóstico rápido de Hib (tabla 2), es importante destacar primero, aunque nuestro objetivo no fue demostrar la superioridad de las técnicas de diagnóstico rápido sobre el cultivo bacteriológico, que este último permitió solo el aislamiento en 158 muestras de LCR. En cambio, la aglutinación de partículas de látex por ejemplo, en este mismo tipo de muestra, detectó hasta 30 casos más de MEB debidas a Hib. Se ha demostrado que en ocasiones la recuperación del cultivo bacteriológico es baja debido a factores como la administración al paciente de antimicrobianos, el manejo inadecuado de las muestras y su procesamiento en el laboratorio.^18,19

La inferioridad de los porcentajes de detección de antigenuria y antigenemia constituye otro aspecto a destacar en la tabla 2. Como ya planteamos en la presentación de los resultados esto sucedió tanto para nuestros reactivos como para los comerciales, y pensamos se deba al hecho de que las muestras de orina y suero pueden ofrecer falsos resultados positivos y negativos, ya sea por reacciones cruzadas, bajos niveles de antígeno u otras infecciones.^16,20

Si nos concentramos en el análisis de los resultados obtenidos en el diagnóstico rápido a partir de muestras de LCR (tabla 3), se hace evidente que el Lat-Haemob se comportó a la altura del látex Wellcogen, alcanzando índices de sensibilidad y especificidad del 100 %.

La concordancia en el número de casos (188 muestras de LCR) en las que se identificaron a Hib como el agente responsable de las meningitis diagnosticadas por la clínica, sugiere que otros agentes son los responsables de los 70 restantes cuadros clínicos. Esto pudo ser corroborado en 6 de ellas, en las cuales se confirmaron positivos por cultivo: 3 LCR para Neisseria meningitidis, 2 LCR para Streptococcus pneumoniae y uno para Streptococcus grupo B.

Al igual que para el serotipaje la sensibilidad de nuestro antisuero (AsHib--IPK) es ligeramente inferior (98,9 %) para el diagnóstico rápido por CIE, con respecto al As DIFCO, pero independientemente del antisuero empleado la CIE no fue tan efectiva. Esto responde a que constituye un método más complejo, laborioso y de una sensibilidad menor.^16,20

Los reactivos AsHib-IPK y Lat- Haemob, desarrollados en el Laboratorio IRAB del IPK, detectan el antígeno capsular específico de Hib en el mismo rango de especificidad y sensibilidad observados para sus análogos comerciales, por lo que proponemos su validación por los organismos nacionales acreditados. La introducción de estos productos en la red nacional cubana de salud pública contribuirá, con un considerable ahorro de recursos, a la prevención de la morbilidad y mortalidad de las infecciones producidas por Hib, cuyas principales víctimas son niños pequeños (entre 2 meses y 5 años).

Summary

A latex reagent and an antiserum for counterimmunoelectrophoresis (CIE)and capsular swelling (CS), both produced by the Acute Bacterial Respiratory Infections Lab of "Pedro Kourí" Institute were tested in the detection of a Haemophilus influenzae type B- specific capsular antigen. The reagents were evaluated in the serotyping of 786 Hib strains isolated from invasive diseases and nasopharyngeal carriers and in the rapid diagnosis of cerebrospinal fluid, serum and urine samples taken from 258 patients with clinical diagnosis of meningoencephalitis. Satisfactory sensitiviy and specificity indexes were obtained, which were determined by using Hib antiserum traded by DIFCO for CS technique and CIE and latex reagent Wellcogen for the Hib diagnosis as a reference. This paper proposes the validation of both reagents by authorized national bodies so that they can be introduced in the Cuban health care network.

]]> Subject headings: HAEMOPHILUS INFLUENZAE TYPE B isolation & purification; INDICATORS AND REAGENTS; MENINGOENCEPHALITIS/diagnosis; LATEX FIXATION TESTS; COUNTER INMUNOELEC-TROPHORESIS; HAEMOPHILUS INFECTIONS/diagnosis.

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Recibido: 5 de enero del 2001. Aprobado: 9 de febrero del 2001.
Lic. Gilda Toraño Peraza. Centro Nacional de Referencia para Haemophilus. Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí", municipio Marianao 13, Ciudad de La Habana, apartado 601, Cuba.

¹ Master en Bacteriología-Micología. Licenciada en Microbiología. Investigadora Agregada.
² Licenciada en Microbiología. Investigadora Auxiliar.
³ Master en Microbiología. Licenciada en Bioquímica. Aspirante a Investigadora.
⁴ Licenciada en Microbiología. Reserva Científica. ]]> ⁵ Especialista de II Grado en Microbiología. Investigadora Auxiliar.
⁶ Master en Epidemiología. Licenciada en Matemática. Aspirante a Investigadora.