Centro de Estudios de Biotecnología Industrial
Facultad de Ciencias Naturales y Matemáticas, Universidad de Oriente

Validación de un método potenciométrico para la determinación de nitrógeno amínico en hidrolizados proteicos de microalgas

Humberto Joaquín Morris Quevedo,1 Ángel Almarales Arceo,2 Katherine Romero Viamonte3 y Milene Vidal Colás3

Resumen

El sistema de valoración de aminoácidos o de mezclas de aminoácidos en presencia de un exceso de formaldehído se utiliza como método analítico, particularmente para monitorear la formación de aminoácidos libres durante la hidrólisis de las proteínas. Se realizó la validación del método potenciométrico de valoración con formaldehído (USP XXIV, 2000) para la determinación cuantitativa de nitrógeno amínico en hidrolizados proteicos de la microalga Chlorella vulgaris. Teniendo en cuenta la clasificación del método, se evaluaron los parámetros: linealidad, precisión, exactitud y especificidad. La técnica es fiable ya que no es afectada por interferencias provocadas por otras sustancias presentes en el hidrolizado; además, el procesamiento estadístico de los datos evidenció la linealidad, precisión y exactitud del método. El procedimiento validado es simple y rápido, por lo que puede ser aplicado en la cuantificación de nitrógeno amínico en lotes de hidrolizado proteico obtenidos en nuestros laboratorios.

DeCS: POTENCIOMETRIA; AMINOACIDOS/análisis; NITROGENO/análisis; ALGAS VERDES; HIDROLISADOS DE PROTEINA/análisis; HIDROLISADOS DE PROTEINA/uso terapéutico; CHLORELLA; DIETOTERAPIA; BIOTECNOLOGIA.

Diversos han sido los estudios experimentales y clínicos que han aportado numerosas evidencias relacionadas con la utilización de los hidrolizados proteicos como preparados bioestimulantes en los sectores médico-farmacéutico, biotecnológico y nutricional. El uso de dietas basadas en hidrolizados proteicos es muy útil en la terapia nutricional de enfermedades de la mucosa gastrointestinal, en pacientes hipercatabólicos, síndromes de malnutrición1 y en la disminución de las reacciones anafilácticas atribuidas a proteínas y macropéptidos.2

Otros efectos terapéuticos asociados con la administración de hidrolizados proteicos están relacionados con el incremento de la función destoxificadora del amonio en el tejido muscular3 y por otra parte, se ha sugerido que los hidrolizados de las proteínas influyen en la regulación endocrina de los procesos metabólicos.4

Entre los principales indicadores de calidad de estos productos figuran los parámetros relacionados con el contenido de nitrógeno. Se destaca el N-amínico como un indicador de gran utilidad para monitorear la marcha de la hidrólisis y establecer la eficiencia final del proceso. En la literatura aparecen reportados varios métodos para la determinación del N-amínico en hidrolizados proteicos, como el método gasométrico de Van-Slyke, por valoración directa de los grupos amino liberados en disolución acetónica con HCl y a-naftol como indicador, o en disolución de ácido acético glacial con ácido perclórico y azul cresol como indicador y por precipitación de las sales cúpricas de los aminoácidos según el método de Pope y Stevens.5

Por el alto grado de complejidad de estos métodos, desde el punto de vista práctico de ejecución, en la USP XXIV se propone un procedimiento que consiste en una valoración potenciométrica con hidróxido de sodio en presencia de un exceso de formaldehído.6 El presente trabajo se propone la validación de este método potenciométrico para la determinación de N-amínico en hidrolizados proteicos de microalgas teniendo en cuenta las regulaciones establecidas para asegurar el cumplimiento de las buenas prácticas de laboratorio (BPL).

Métodos

La determinación de N-amínico se realizó según el método potenciométrico descrito en la USP XXIV (2000)6 en presencia de un exceso de formaldehído. Se utilizó como agente valorante una disolución de hidróxido de sodio 0,1 mol/L. Las valoraciones se efectuaron en un potenciómetro digital Pracitronic MV 870 con electrodo combinado de vidrio calomel y equipo de agitación magnética. Se calibró de acuerdo con el procedimiento establecido, midiendo los valores de pH de las disoluciones tampones utilizadas en la calibración del equipo después de cada 5 mediciones en el potenciómetro.7

Cada mililitro de hidróxido de sodio 0,1 mol/L consumido durante la valoración equivale a 1,4 mg de N-amínico.

Los parámetros que se tuvieron en cuenta para la validación del método fueron linealidad, precisión, exactitud y espe-cificidad.8

En el ensayo de linealidad se valoraron hidrolizados de concentraciones comprendidas entre 40-240 mg%. Se realizó un análisis de regresión lineal simple y adicionalmente, se aplicó la prueba de la t de Student con la finalidad de determinar la significación de la correlación lineal.9

En el ensayo de precisión se tomaron en consideración los criterios de repetibilidad y reproducibilidad. El análisis de repetibilidad se realizó procesando una muestra de concentración 125 mg% 20 veces el mismo día bajo idénticas condiciones experimentales y para la reproducibilidad se procesó dicha muestra durante 20 d consecutivos. Los resultados fueron evaluados en términos de la desviación estándar y el coeficiente de variación.

En el estudio de la exactitud del método fueron analizadas por triplicado 5 muestras de concentraciones comprendidas en el rango lineal: 65, 125, 160, 190 y 220 mg%. Se determinó la correlación entre las cantidades teóricas con los valores encontrados experimentalmente y se precisaron los intervalos de confianza del intercepto y de la pendiente para los niveles de significación de 0,05 y 0,01.10

Con el objetivo de estudiar las posibles interferencias de otras sustancias diferentes de los aminoácidos y péptidos presentes en el hidrolizado proteico, se añadió 1 mL del hidrolizado de la microalga Chlorella vulgaris a alícuotas de una solución estándar de alanina con una concentración de N-amínico de 2,5 mg/mL. Se compararon los valores teóricos y experimentales de N-amínico en las muestras y se realizó un análisis de regresión lineal simple, estimando las ecuaciones de regresión y los coeficientes de determinación.

Resultados

Los valores de pH de las disoluciones tampones medidos después de cada 5 valoraciones realizadas en el potenciómetro se mantuvieron dentro de los rangos establecidos7 (7,00 ± 0,02 CV=0,28 % y 9,18 ± 0,04 CV=0,44 %), por lo que los resultados de las valoraciones aportados por el equipo se consideran correctos.

El método evaluado presentó una respuesta lineal en el intervalo comprendido entre 40 y 240 mg% (tabla 1) y el coeficiente de correlación mostró un valor cercano a la unidad. El coeficiente de variación del coeficiente de regresión (pendiente) fue menor que el establecido de 5 %11 y el intervalo de confianza del intercepto incluye al cero.

Volumen de NaOH 0,1 N consumido (mL) vs. mg% de N-amínico.

En el ensayo de precisión (tabla 2), los coeficientes de variación de la repetibilidad y reproducibilidad están por debajo del 5 %. Las variaciones introducidas en el ensayo de reproducibilidad no influyeron sobre los resultados.

Tabla 2. Resultados del ensayo de precisión de la técnica potenciométrica para la determinación de N-amínico

Concentración de N-amínico en la muestra: 125 mg %.

Las evidencias obtenidas en el estudio de exactitud (tabla 3) demostraron la no existencia de errores sistemáticos constantes ni proporcionales. En todos los casos el porcentaje de recobrado estuvo entre 98 y 101 %.

Tabla 3. Resultados del ensayo de exactitud de la técnica potenciométrica para la determinación de N-amínico

En el ensayo de especificidad (tabla 4), el porcentaje de recobrado medio fue del 100,2 % y la desviación estándar del 1,32 %. Al aplicar el test t no se encontraron diferencias significativas entre las cantidades teóricas y las detectadas experimentalmente con un grado de probabilidad superior al 99 %. Por otra parte, las ecuaciones de regresión (tabla 5) mostraron que los valores de los coeficientes de regresión (pendientes) correspondientes a la solución patrón y a la solución patrón más 1 mL del hidrolizado son muy similares.

Tabla 4. Análisis de la especificidad del método potenciométrico para la determinación de N-amínico (I). Estudio de recobrado

Tabla 5. Análisis de la especificidad del método potenciométrico para la determinación de N-amínico (II). Ecuaciones de regresión y parámetros asociados

Discusión

La linealidad del método evaluado en el intervalo comprendido entre 40 y 240 mg % (coeficiente de correlación cercano a la unidad) indica la existencia de una proporcionalidad entre las concentraciones de N-amínico y el volumen de NaOH 0,1 mol/L consumido en las valoraciones, con un grado de probabilidad superior al 99,9 %.

Los coeficientes de variación tanto de la repetibilidad como de la reproducibilidad, inferiores al 5 %, se consideran aceptables para este tipo de análisis.

En el estudio de exactitud se excluyó la existencia de errores sistemáticos constantes y proporcionales al cumplirse los requisitos10 de que para ambos niveles de significación el intervalo de confianza de la pendiente debe incluir al 1 y el del intercepto al 0.

Los resultados del ensayo de especificidad demostraron la no existencia de sustancias que puedan interferir en el procedimiento.

El método de valoración potenciométrica validado para la determinación cuantitativa de N-amínico en hidrolizados proteicos de microalgas resultó lineal en la región estudiada, es exacto, preciso y específico, lo que garantiza la obtención de resultados fiables. A diferencia de los otros métodos citados en la introducción, la técnica es simple y rápida y no requiere de grandes cantidades de reactivos y muestras, por lo que puede ser aplicado en el control de la calidad de los lotes hidrolizados proteicos obtenidos en nuestros laboratorios.

Summary

The system of assessment of amino acids or of amino acid mixtures in the presence of an excess of formaldehyde is used as an analytical method to monitor the formation of free amino acids during protein hydrolysis. The potentiometric method of assessment with formaldehyde (USP XXIV, 2000) was validated for the quantitative determination of aminic nitrogen in protein hydrolysates from Chlorella vulgaris microalga. The following parameters were evaluated taking into account the classification of the method: lineality, accuracy, exactitude and specificity. The technique is reliable, since it is not affected by interferences caused by other substances present in the hydrolysate. Besides, the statistical processing of the data proved the lineality, accuracy and exactitude of the method. As the validated procedure is simple and rapid, it may be applied to the quantification of aminic nitrogen in batches of protein hydrolysate obtained in our laboratories.

Subject headings: POTENTIOMETRY; AMINO ACIDS/analysis; NITROGEN//analysis; ALGAE, GREEN; PROTEIN HYDROLYSATES/analysis; PROTEIN HYDROLYSATES/therapeutic use; CHLORELLA; DIET THERAPY; BIOTECHNOLOGY.

Referencias bibliográficas

1. Baró L, Guadix EM, Martínez-Augustin O, Boza JJ, Gil A. Serum amino acid concentration in growing rats fed intact protein versus enzymatic protein hydrolysate based diets. Biol Neonate 1995;68:55-61.
2. Lee YH. Food-processing approaches to altering allergenic potential of milk-based formula. J Pediatr 1992;121(5):47-50.
3. Margalamov AG, Levechencho IV, Anoshina MI, Ishchuk DE. The enzymatic activity of ammonia metabolism in the liver during the parenteral nitrogen feeding of animals with experimental liver failure. Vrach Delo 1992;(3):46-8.
4. Malikova NA, Marokko IN, Samenkova NF, Gmoshinskii IV, Mazo VK. The effect of cow´s milk and its hydrolysates on the metabolisms of 17-hidroxycorticosteroids and the functional state of the gastrointestinal tract in guinea pigs. Vopr Pitan 1991;(4):48-52.
5. Villar V, Santos A. Tratado de Bioquímica. 3 ed. La Habana: Editorial Pueblo y Educación, 1967; t 1.
6. United States Pharmacopeial Convention. USP XXIV: United States Pharmacopoeia and National Formulary. 24 ed. Rockville: Mack Printing, 2000:1438.
7. British Pharmacopoeia Commission. Determination of pH values. London: Her Majesty´s Stationery Office, 1988:A103.
8. Castillo B, González R. Protocolo de validación de métodos analíticos para la cuantificación de fármacos. Rev Cubana Farm 1996;30(1):43-51.
9. Sigarroa A. Biometría y diseño experimental. La Habana: Editorial Pueblo y Educación, 1985:498-570.
10. Statistical Validation. Quantitative determination. Basel: F. Hoffman-La Roche, 1987:1-8.
11. Calpena AC, Escribano E, Fernández C. Validación de los métodos analíticos. Farm Clin 1990;7(9):749-58.

Recibido: 2 de octubre del 2001. Aprobado: 14 de noviembre del 2001.
M.Sc. Humberto Joaquín Morris Quevedo. Agramonte No. 58, entre Veteranos y Correoso, El Cristo, Santiago de Cuba, CP 94310, Cuba.

1 Master en Bioquímica de la Nutrición. Investigador Agregado. Centro de Estudios de Biotecnología Industrial, Universidad de Oriente.
2 Licenciado en Química. Aspirante a Investigador. División de Biotecnología Solar. Centro de Investigaciones de Energía Solar.
3 Licenciada en Farmacia. División de Biotecnología Solar. Centro de Investigaciones de Energía Solar.