Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos
Armando Gato del Monte,1 Adriana M. Martín Callejas,2 Leydis García León,3 Martha Gómez Carril,4 y Rafael León Rodríguez5
Se realizó el estudio de preformulación de mitomicina C 2 mg para la elaboración de un liofilizado física y químicamente estable. Se describieron brevemente los pasos que se siguieron para la disolución del principio activo. Los estudios de estabilidad por el método de vida de estante en condiciones normales de temperatura y en refrigeración utilizando la cromatografía líquida de alta resolución, permitió cuantificar el principio activo y establecer el tiempo de vida útil del producto terminado, así como reconstituido. Se comprobó la ausencia de microorganismos vivos y en desarrollo al producto terminado. ]]>
Palabras clave: mitomicina, citostático, estabilidad, inyectables.
Las mitomicina A, B y C conforman un grupo de antibióticos con propiedades citotóxica y antibacteriana, derivadas de una estructura común denominada mitosana y que se producen por especies del género Streptomyces.1
La mitomicina C es un antibiótico que fue aislado y estudiado de la Streptomyces caespitosus por los investigadores japoneses Hata y otros en 1955 y en 1958 por Wakaki y otros.2-4 Contiene un grupo uretano y un grupo quinona en su estructura, así como un anillo de aziridina, que es esencial para la actividad antineoplásica.3
Este fármaco según el certificado de análisis del fabricante tiene una potencia no menor de 970 µg/mg, que muestra fotosensibilidad por el oxígeno del aire; además, el pH de las disoluciones de mitomicina en agua se encuentra entre 6,0 y 8,0.5 Estas por su poca estabilidad en medio acuoso se conservan en congelacion6,7 o liofilizado.5
El objetivo este trabajo fue desarrollar una formulación de mitomicina C a una concentración de 2 mg por bulbo y evaluar la estabilidad del producto terminado y reconstituido para determinar la fecha de vencimiento y las temperaturas de almacenamiento adecuadas en ambos preparados.
Se utilizó mitomicina C, lote No. 940201 de la firma Flavine SA, España, con una concentración de 1003,4 µg/mg, manitol de la firma Raquete, Francia, cremophor EL de la BASF, RFA, agua para inyección de calidad farmacéutica y condiciones asépticas según las BPF, para lo cual se utilizó sistemas de barreras a fin de proteger al medio ambiente y al personal que trabajó en la elaboración del producto. ]]>
Las materias primas y reactivos empleados fueron de calidad farmacéutica.
En la primera variante del procedimiento tecnológico la cantidad de manitol y el principio activo en una cantidad de 200 mg fue añadido a un recipiente que contenía 80 mL de agua para inyecciones con constante agitación a 400-500 r.p.m. Se ajustó el pH del medio con solución hidróxido de sodio 0,01 N a los límites establecidos de 6,0 a 8,0.
Se realizó otra preparación como variante dos, siguiendo el procedimiento anterior, pero utilizando una concentración de cremophor al 0,1 %, con sonificación en un baño ultrasónico ¨Bransonic¨, por un tiempo de 30 min.
Se estudió como tercera variante la disolución de la mitomicina en agua para inyecciones a los valores de pH 6,0; 6,5; 7,0; 7,5 y 8,0, con el ajuste previo del medio de disolución, que en los ensayos anteriormente realizados fue de alrededor de 5,5 a 6,5.
En la cuarta variante se ajustó el pH del medio con solución hidróxido de sodio 0,01 N a los límites establecidos de 6,0 a 8,0 para este producto; el principio activo en una cantidad de 200 mg fue añadido a un recipiente que contenían 80 mL de agua para inyecciones con constante agitación a 400-500 r.p.m. Se enrasó el producto a un volumen de 100 mL con agua para inyecciones, y se obtuvo una concentración final de 2 mg de mitomicina C/mL.
La filtración se realizó por membrana de acetato de celulosa de 0,2 µm y prefiltro de fibras de vidrio.
Se dosificó el producto bajo flujo laminar a viales por 5 mL de diámetro interior, incoloros de calidad hidrolítica I, y se le colocaron tapones de goma butílicos de 20 mm de diámetro, específicos para liofilizar.
El proceso de liofilización se llevó a cabo a una temperatura máxima de -40 ºC. La temperatura del condensador fue de -50 ºC, el tiempo de enfriamiento de 2 h y el calentamiento de las platinas de 30 ºC. Después de terminado el ciclo de liofilización se selló el producto con casquillos de aluminio anodinados.
Al producto liofilizado se le realizaron controles físico-químicos, microbiológicos y biológicos, los cuales se muestran en la tabla 1.
Método analítico. Se empleó la cromatografía líquida de alta resolución, establecida en la USP 248 para la determinación del principio activo, la cual utiliza una fase móvil constituida por 1,54 g acetato de amonio, 250 mL de metanol y 5 mL de ácido acético 0,83 N en un volumen de 1 000 mL de agua desionizada. Esta disolución se filtró por un filtro de vidrio poroso 0,45 µm, y el filtrado obtenido se desgasificó. ]]>
Se utilizó un detector UV a 365 nm, una columna cromatográfica hypersil fenil 5 µm de 4 x 30 mm KNAUER y la velocidad de flujo de 2 mL/min.
Se prepararon 2 disoluciones de mitomicina en N,N dimetilacetamida 0,5 a 0,75 mg/mL. Para la valoración de producto terminado se utilizó una concentración de 0,5 mg/mL con el mismo disolvente
Estudios de estabilidad. Este estudio se realizó por el método de vida de estante. Se emplearon muestras de los 3 lotes rotulados según 037, 063, 072 y se almacenaron a temperatura ambiente entre 25 y 30 ºC, se valoraron periódicamente a los 3, 6, 9 y 12 meses de fabricados.
También se realizó al lote 063 la estabilidad a la mitomicina C reconstituida en dextrosa al 5 %, cloruro de sodio al 5 % y agua para inyección a temperatura ambiente entre 25 y 30 ºC y en refrigeración entre 2 y 8 ºC. Se comparó la concentración inicial que fue de 113,31 % con la obtenida a las 24 h.
Los resultados se procesaron estadísticamente, se ajustaron a una ecuación lineal, y se consideraron ln C (logaritmo de la concentración) como las Y y el tiempo (en horas) como las X. Se utilizó el Software Microcal Origin 4,0.
Pirógenos. Los conejos de la raza NZB con peso promedio entre 1,8 y 2,0 kg fueron ubicados en condiciones de temperatura entre los 20 ± 2 °C y humedad relativa entre 50 y 60 %. Además, los niveles de ruido en el local se mantuvieron bajos. Los animales fueron ubicados en jaulas individuales para facilitar su manejo. Después de 90 min en el local, se realizó la primera toma de temperatura rectal, utilizando un termómetro clínico y a los 30 min siguientes la segunda toma, para proceder inmediatamente a la inyección en la vena marginal de la oreja del conejo de 2,5 mL/kg de peso de una solución, que se preparó disolviendo el contenido del bulbo de mitomicina en 10 mL de la solución estándar de cloruro de sodio 0,9 % libre de pirógenos, con agitación posterior durante 5 min.
Finalizada la inyección se comenzó a contabilizar el tiempo, y en cada hora se realizaron 3 mediciones de temperatura.
El producto liofilizado presenta características físicas, químicas, microbiológicas y biológicas que se corresponden con las especificaciones de calidad de la USP 24.8 (tabla 1).
]]> ]]> TABLA 1. Resultados a tiempo cero de los lotes elaborados| Parámetros | Lotes | Límites USP 248 | ||
| 037 | 063 | 072 | ||
| Características organolépticas | Cumple | Cumple | ]]> Cumple | Matriz liofilizada, homogénea y compacta, de color azul |
| pH | 6,5 | 6,9 | 6,7 | 6,0-8,0 |
| Identificación | Cumple | Cumple | Cumple | El tiempo de retención de la muestra coincide con el de la sustancia química de referencia |
| Valoración (%) | ]]> 100,55 | 113,31 | 101,99 | 90,0-120,0 |
| Contenido de agua (%) | 1,1 | 1,3 | 0,9 | < 5 % |
| Esterilidad | Cumple | Cumple | ]]> Cumple | No presenta crecimiento microbiano |
| Pirógenos | Cumple | Cumple | Cumple | Libre de pirógenos |
Las muestras estudiadas a temperatura ambiente, a los 12 meses de analizadas presentan pérdida de potencia, las que se corresponden con la disminución del pH (tabla 2).
La mitomicina mantiene una estabilidad mayor en disolución de cloruro de sodio al 0,9 %, seguida por el agua para inyecciones y dextrosa al 5 %.
Se observa la perdida de casi el 10 % de la valoración inicial del principio activo.
TABLA 2. Valoración de la mitomicina C a temperatura ambiente
| Parámetros | Lotes/fecha de fabricación | |||||
| 037/4.99 | 063/5.99 | 072/9.99 | ||||
| 3 meses | ]]> 12 meses | 3 meses | 12 meses | 3 meses | 12 meses | |
| Características organolépticas | Cumple | Cumple | Cumple | Cumple | Cumple | ]]> Cumple |
| pH | 6,3 | 6,1 | 7,1 | 6,3 | 7,2 | 6,7 |
| Valoración (%) | 97,43 | 92,15 | 113,47 | ]]> 105,83 | 97,99 | 91,96 |
TABLA 3. Valoración de mitomicina C reconstituida
| Parámetros | Valoración del ensayo 037 | |||
| Temperatura ambiente | Refrigeración | |||
| Tiempo 0 | 24 h | Tiempo 0 | ]]> 24 h | |
| Dextrosa 5 % | 100,0 | 90,32 | 100,0 | 91,67 |
| Cloruro de sodio 0,9 % | 100,0 | 91,42 | 100,0 | 96,35 |
| Agua para inyecciones | 100,0 | ]]> 90,87 | 100,0 | 92,91 |
Para lograr la solubilidad de la mitomicina se realizaron varios ensayos, debido a que al añadir el principio activo sobre el agua para inyecciones con constante agitación este no se disolvió, aunque fue ajustado posteriormente el pH de la solución a los límites establecidos para dicho producto según la variante uno.
En base a la variante dos, con el uso del Cremophor EL, de alto HLB y compatible con la vía parenteral, no se facilitó la disolución de la mitomicina, aunque se sonificó la solución durante 30 min.
El perfil de pH realizado entre 6,0 y 8,0 según la variante tres, permitió definir que a valores de pH por debajo de 6,0 no es posible disolver la mitomicina, ya que esta se degrada rápidamente sin restablecimiento de la molécula, la que da aspecto de insolubilidad, por lo que la solución necesita ser primeramente ajustada a pH alrededor de 7 ± 1, según la variante cuatro.
Los estudios de estabilidad realizados al lote 037 reconstituido con agua para inyecciones, almacenado a temperatura ambiente 25-30 ºC y en refrigeración 2-8 ºC, se muestran en la tabla 3. Según el procesamiento estadístico, la disolución de cloruro de sodio al 0,9 % presenta una mayor estabilidad en relación con el resto de las disoluciones analizadas a temperatura ambiente, con una vida útil mayor en refrigeración 2-8 ºC con 55 h y de 24 h a 25-30 ºC a partir de la ecuación: (tiempo) = ln90 %-intercepto/pendiente.
Se logró la esterilidad de la preparación en los 3 lotes estudiados, lo que demuestra que el procedimiento tecnológico empleado y las condiciones ambientales son las adecuadas para este medicamento. Tampoco se observó presencia de pirógenos en los productos terminados.
The study of preformulation of mitomycin C 2 mg was conducted to obtain a physical and chemically stable lyophilized. The steps followed for the disolution of the active principle were briefly described. The stability studies by the shelf life method under nomal conditions of temperature and refrigeration using high resolution liquid chromatography allowed to quantify the active principle and to establish the time of useful life of the finished and reconstituted product. The absence of living and developing microorganisms in the finished product was proved.
Key words: mitomycin, cytostatic, stability, injection.
Recibido: 6 de octubre de 2003. Aprobado: 14 de noviembre de 2003.
MSc. Armando Gato del Monte. Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos. Ave. 26 No. 1605, entre Boyeros y Puentes Grandes, municipio Plaza de la Revolución, CP 10 600, Ciudad de La Habana, Cuba. Email: cinfa@infomed.sld.cu
1 Master en Tecnología Farmacéutica y Control de Medicamentos. Investigador Agregado.
2 Licenciada en Ciencias Farmacéuticas.
3 Licenciada en Radioquímica. Investigadora Agregada.
4 Master en Tecnología Farmacéutica y Control de Medicamentos. Investigadora Auxiliar.
5 Licenciado en Química. Investigador Auxiliar.