Caridad M. García Peña,1 Rafael Diego León,2 Mirta Castiñeira Díaz,3 Mirna Fernández Cervera3 y Vivian Martínez Espinosa4
Se desarrolló y validó un método para evaluar la disolución de las tabletas de clonazepam 2 mg sin lactosa por cromatografía líquida de alta resolución, con detección ultravioleta a 254 nm. Se comprobó la condición de insaturación del clonazepam en el medio de disolución empleado y se evaluaron los parámetros de especificidad, linealidad y precisión, así como la influencia de la filtración y la estabilidad del principio activo. La curva de linealidad se realizó en el rango de 1,2 a 2,6 µg/mL con un coeficiente de correlación igual a 0,99418; la prueba estadística para el intercepto y la pendiente se consideró no significativa. En el estudio de estabilidad del principio activo en el medio de disolución se demostró que era estable en el medio por más del doble del tiempo de duración del ensayo de disolución.
Palabras clave: Clonazepam, validación, ensayo de disolución.
El clonazepam es una benzodiazepina que actúa en general como depresores del sistema nervioso central (SNC), y produce todos los niveles de depresión de este, desde una leve sedación hasta hipnosis o coma en dependencia de la dosis. Está indicado para el tratamiento solo o, como coadyuvante en la mayoría de las formas clínicas de la epilepsia, particularmente las ausencias típicas y atípicas. Se indica también para el tratamiento del desorden o trastorno de pánico.1-4
El ensayo de disolución constituye uno de los estudios más importantes en el desarrollo de una forma farmacéutica sólida oral. Permite evaluar los procesos de fabricación, la calidad intralotes e interlotes, además de predecir en algunos casos la bioequivalencia y biodisponibilidad de productos sólidos orales y la estabilidad del preparado farmacéutico.5,6 Como en la Farmacopea de Estados Unidos, USP 27, 2004, se reporta para las formas dosificadas de clonazepam métodos cromatográficos para la valoración y el ensayo de disolución, con la utilización para cada uno de ellos de reactivos y columnas diferentes, se decide desarrollar un método cromatográfico común para la valoración como para el ensayo de disolución, ya que es mucho más económico, sencillo y rápido el análisis químico completo del producto terminado.7 Existen otros métodos cromatográficos reportados, en diferentes revistas, para el análisis de las tabletas de clonazepam, pero el método desarrollado ofrecía mejores resultados para las tabletas de clonazepam 2 mg sin lactosa.8
Como en todo método analítico, es indispensable efectuar la validación de este, para facilitar la utilización rutinaria con la fiabilidad adecuada. La USP 27 plantea para el ensayo de disolución (categoría III) el estudio de la precisión, mientras que los restantes parámetros se realizarán en dependencia de la naturaleza específica del ensayo. Sin embargo, en la literatura especializada se incluyen aspectos tan importantes como: la comprobación de la condición de insaturación, la especificidad con respecto al placebo, la linealidad y precisión, la influencia de la filtración y la estabilidad del principio activo.9-11
El presente trabajo tuvo como objetivo el desarrollo y la validación del método de disolución empleado para el estudio de estabilidad de las tabletas de clonazepam 2 mg sin lactosa.
La sustancia de referencia química utilizada es suministrada por el Departamento de Patrones del Laboratorio de Aseguramiento de la calidad perteneciente al Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos (CIDEM).
Se realizaron ensayos de disolución de las tabletas por el método reportado en la USP y por el método desarrollado, con el objetivo de realizar una comparación estadística entre los resultados por el método reportado en la Farmacopea y los obtenidos por el método analítico alternativo desarrollado con el empleo para ello de un estudio de la t de Student afin de determinar si existían diferencias significativas entre los 2 métodos.
Las condiciones cromatográficas empleadas para realizar el análisis por el método de la USP 27, 2004, son las siguientes: un cromatógrafo (KNAUER) con detector UV/VIS (KNAUER) ajustado a 254 nm, un dosificador de 100 μL e integrador (SHIMADZU CR 8 A). La separación se realiza isocráticamente sobre una columna Lichrospher 100, RP-8, 250 x 4mm, (5 µm). La fase móvil consiste en una mezcla filtrada y desgasificada de 3 componentes:agua destilada:metanol:acetonitrilo (40:30:30), con una velocidad de flujo de 1,0 mL/min.
En el desarrollo del método analítico alternativo, se emplea un cromatógrafo (KNAUER) con detector UV/VIS (KNAUER) ajustado a 254 nm, un dosificador de 200 μL e integrador (SHIMADZU CR 8 A). La separación se realiza isocráticamente sobre una columna Lichrospher 100, RP-18, 250 x 4mm, (5 µm). La fase móvil consiste en una mezcla desgasificada de solución de fosfato de amonio anhidro dibásico a pH= 8,0:metanol:tetrahidrofurano (62:50:13) con una velocidad de flujo de 1,5 mL/min.7
Las condiciones del ensayo de disolución utilizadas para ambos métodos son:9
Aparato: paleta, 100 rev/min.
Medio: agua destilada desgasificada, 900 mL.
Tiempo: 1 h.
Equipo: disolutor Erweka DT 6 RE de 6 plazas.
Todos los reactivos responden a la calidad analítica (Merck, para uso en cromatografía líquida de alta resolución) requerida para el estudio.
Se comprueba la condición de insaturación tomando en consideración la solubilidad del clonazepam en agua a 37 °C reportada en la literatura.12 Debe cumplirse que Cs < 0,15 S, donde Cs representa la concentración máxima de clonazepam disuelta en las condiciones de ensayo y S es la solubilidad del clonazepam en agua a 37 °C.9
Este estudio se realiza con el empleo de 6 unidades del placebo y según el procedimiento descrito para el ensayo de disolución, con el objetivo de determinar las posibles interferencias de los excipientes de la formulación en la determinación del principio activo. Debe cumplirse que no debe detectarse señal cuantificable del placebo en la zona de elución del principio activo.10
Para el estudio de la linealidad de la respuesta del detector se prepara una curva de calibración con soluciones patrón de clonazepam tabletas en un rango de concentraciones de 1,2 a 2,6 µg/mL que representan del 60 al 140 %, de la cantidad declarada en la formulación. Debe cumplirse que el coeficiente de correlación (r ≥ 0,999); el coeficiente de variación de los factores de respuesta (CVf ≤ 5 %); en la prueba de significación del intercepto, mediante la prueba de la t de Student, la t calculada (t cal) debe ser menor que la t tabulada (t tab).11,12
La precisión se estudia con el empleo de muestras de 6 tabletas y la evaluación en 2 días diferentes. Debe cumplirse para un método lineal que los valores de t calculada de cada muestra debe ser menor que el valor de t tabulada.13
Se evalúa la influencia de la filtración, para ello se analizan 6 unidades del lote comparándose entre sí los resultados de las muestras filtradas con filtro de línea con las muestras centrifugadas a 3 000 rev/min durante 10 min. Debe cumplirse que los valores de t calculada para cada una de las muestras al compararse estadísticamente los resultados obtenidos de cada uno de los medios filtrantes, debe ser menor que el valor de la t tab.11
Teniendo en cuenta la dosis de la tableta (2 mg) y el volumen empleado del medio de disolución (900 mL), se comprueba que la condición de insaturación en el ensayo se cumple pues la concentración máxima que alcanza el clonazepam es de 2,2 µg/mL, valor muy inferior al 0,15 S, equivalente a 19 μg/mL.
La figura muestra los resultados obtenidos en el estudio de especificidad del método. Como puede observarse en el cromatograma correspondiente a la muestra placebo (C) no se obtiene ninguna señal en la zona de interés, al ser comparado con la obtenida para la sustancia de referencia química (A) y de la muestra de clonazepam (B).
Fig. Resultados del estudio de especificidad del método. A) Cromatograma de la sustancia de referencia química. B) Cromatograma de la muestra. C) Cromatograma del placebo.
Al aplicar el método de los mínimos cuadrados a los resultados registrados, se obtuvo la ecuación de la recta que se expresa según: y= 89250,37374 X – 1409,7116. El coeficiente de correlación lineal fue de 0,99418. Al aplicar la prueba de linealidad, utilizando el coeficiente de variación de los factores de respuesta, se obtuvo un CVf= 0,93 %, y al realizar la prueba de significación de la pendiente, el valor de t calculada (t cal= 2,57) resultó menor que la t tabulada (t tab= 3.18).
En la tabla 1 se exponen los resultados de este estudio al analizar las tabletas de clonazepam 2 mg sin lactosa, en 2 días diferentes. Se reportan además los valores de la prueba de la t de Student calculada para cada muestra.
Tabla 1. Estudio de precisión
| Muestras | ]]> Primer día (%) | Segundo día (%) | t cal |
| 1 | 102,1 | 102,3 | 0,43 |
| 2 | 103,0 | 102,3 | ]]> 0,37 |
| 3 | 100,7 | 101,9 | 1,17 |
| 4 | 100,3 | 101,4 | 1,37 |
| 5 | ]]> 100,1 | 101,0 | 1,03 |
| 6 | 101,3 | 102,1 | 0,91 |
| t tab (95%, 5)= 2,57 | |||
Los resultados de la influencia de la filtración aparecen reportados en la tabla 2, tanto de los ensayos obtenidos empleando muestras centrifugadas como las muestras filtradas con filtro de línea, así como los valores de la prueba de la t de Student calculada para cada hora.
Tabla 2. Resultados de las medias de la influencia del filtrado
]]>| Tiempo (h) | Muestras filtradas por filtro | Muestras centrifugadas |
t cal |
| 1 | 101,7 | 100,7 | 1,01 |
| ]]> 2 | 102,0 | 101,1 | 0,73 |
| 3 | 101,0 | 102,0 | 0,99 |
| 4 | 102,2 | ]]> 101,3 | 0,83 |
| 5 | 100,9 | 100,0 | 0,71 |
| 6 | 102,3 | 102,5 | 0,12 |
| ]]> | t tab (95%, 5)= 2,57 | ||
Los resultados del estudio de la estabilidad del principio activo en el medio de disolución, se presentan en la tabla 3.
Tabla 3. Estudio de la estabilidad del principio activo
| Inicial | 2 h | ||
| Concentración (µg/mL) | Área | Concentración (µg/mL) | ]]> Área |
| 1,5 | 12,65 | 1,5 | 11,19 |
| 1,5 | 12,83 | 1,5 | 11,26 |
| 1,5 | ]]> 12,84 | 1,5 | 11,67 |
| 1,9 | 16,44 | 1,9 | 16,07 |
| 1,9 | 16,82 | 1,9 | ]]> 16,12 |
| 1,9 | 16,83 | 1,9 | 16,19 |
| 2,3 | 20,06 | 2,3 | 20,13 |
| 2,3 | ]]> 20,20 | 2,3 | 20,07 |
| 2,3 | 20,21 | 2,3 | 20,01 |
| Intervalo intercepto [0,00017; 0,22581] | Intercepto 0,14704 | ||
Los resultados de la comparación estadística de los resultados obtenidos por el método reportado en la Farmacopea y el método analítico desarrollado se aprecian en la tabla 4.
]]> Tabla 4. Comparación estadística| USP | Alternativo | Límites |
| 101,7 | 102,1 |
]]> CVf < 5,0 % t cal < t tab |
| Media= 101,4 % | Media= 101,3 % | |
| t cal= 0,34 | ||
Se comprueba que se cumple la condición de insaturación en el ensayo, pues la concentración máxima que alcanza el clonazepam (Cs) es de 2,22 μg/mL, valor muy inferior al 0,15 S, lo que demuestra que a la concentración de trabajo el clonazepam es soluble en el medio de disolución empleado.
Los resultados que se obtienen en el estudio de especificidad, permiten afirmar que el método es específico en relación con los excipientes que componen la tableta porque no se observa interferencia de estos en la zona de absorción del principio activo.
La curva de calibración a 254 nm se comportó de forma lineal en el intervalo de concentraciones comprendidas entre 1,2 y 2,6 μg/mL, con un adecuado valor del coeficiente de correlación. El valor del coeficiente de variación de los factores de respuesta obtenido se encuentra dentro de los límites establecidos (CVf ≤ 5 %), lo que demuestra una adecuada linealidad.
Los resultados del estudio de la precisión muestran que el método es preciso ya que en ningún caso existieron diferencias significativas entre las medias para cada muestra. Como se observa la t calculada resultó ser menor que la t tabulada, una vez realizado el análisis para cada muestra.
No existieron diferencias significativas entre los resultados alcanzados, con el empleo de muestras filtradas y muestras centrifugadas, ya que en todo momento la t calculada resultó ser menor que la t tabulada para cada muestra. Esto permite asegurar que la filtración no adsorbe el principio activo ni aporta interferencias al filtrado, por lo que es posible su empleo.
El principio activo resultó estable en las condiciones del ensayo, ya que los valores del intercepto y de la pendiente después del tratamiento a 37 °C durante 2 h no difieren estadísticamente con respecto a las mediciones iniciales, pues se encuentran comprendidos en los intervalos de confianza respectivos de la curva de calibración inicial (condición necesaria y suficiente para demostrar la estabilidad del principio activo).
Al analizar estadísticamente los resultados obtenidos por ambos métodos, se pudo comprobar que no existen diferencias significativas entre los resultados, al ser la t calculada menor que la t tabulada, lo que demuestra que el método analítico alternativo desarrollado, se puede utilizar tanto en el control de la calidad, como en el estudio de estabilidad del producto terminado, lo cual permite un ahorro en el análisis químico completo, así como una mayor rapidez de los resultados ya que con el empleo del método desarrollado se utiliza los mismos reactivos y columna de la valoración del producto terminado.
A valid method was developed to assess 2 mg Clonazepam tablets disolution without lactose by high-performance liquid chromatography by UV detection to 254 nm. Establishment of Clonazepam in dissolution medium was confirmed, and parameters of specificity, linearity, and accuracy were assessed, as well as influence of filtration and stability or active principle. Linearity curve was drawed in rank of 1, 2-2,6 mg/mL, with a correlation coefficient similar to 0,99418; statistical test wasn’t statistically significant for interceptor and slope. In study, it was possible to demonstrate that stability or active principle in dissolution was maintained in more than double of duration of dissolution assay.
Key words: Clonazepam, valaidation, dissolution assay.
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Recibido: 8 de enero de 2007. Aprobado: 9 de febrero de 2007.
MC. Caridad M. García Peña. Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos (CIDEM). Ave. 26 No. 1605 entre Boyeros y Puentes Grandes. CP. 10 600. Plaza de la Revolución, La Habana, Cuba. Correo electrónico: caridad@cidem.quimefa.cu
1 Master en Tecnología y Control de Medicamentos.
2 Licenciado en Farmacia.
3 Doctora en Ciencias Farmacéuticas.
4 Técnica en Tecnología Farmacéutica.