Análisis microbiológico de plantas medicinales con óxido de etileno

Mausy Lorena Torres Rojas,1 Janeth Arias Palacios,2 Fernando Guatibonza,2 Ana Isabel Oliveros2 y Cindy Fernández López1

Resumen

La utilización de plantas curativas constituye una de las terapias médicas más antiguas y extendidas que se remonta a los tiempos prehistóricos (Wust, 2003). Cada cultura ha desarrollado sus tradiciones de medicina popular, con remedios y ritos que utilizan plantas locales. La Organización Mundial de la Salud, mediante varios comunicados ha expresado su posición con respecto a la necesidad de revalorar la utilización de las plantas medicinales dentro del ámbito sanitario, teniendo en cuenta que el 80 % de la población mundial depende de estas en lo referente a la atención primaria de salud (Alonso, 1998). Frente a esta necesidad y a la preocupación que genera ofrecer productos de alta calidad, la investigación realizada permitió evaluar algunas de las materias primas, como: Boldo (Peumus boldus), Caléndula (Calendula officinalis), Sen (Casia angustifolia Vahl), Fucus (Fucus vesiculosas L) y Spirulina (Spirulina maxima), que son importantes por la gran oferta que estas tienen en el mercado. El objetivo de este estudio fue evaluar la calidad microbiológica y establecer si el proceso de esterilización con óxido de etileno tenía un efecto eficaz sobre la materia prima, propuesta a evaluar. Se realizó el recuento de microorganismos mesófilos aerobios, hongos, levaduras y pruebas de ausencia/presencia para microorganismos patógenos como: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella s.p, Clostridium perfringes y Staphylococcus aureus. Estas pruebas se realizaron con la utilización de medios de cultivo específicos: TSN, EMB, CETRIMIDE, XLD, B.P, OGY (hongos y levaduras) y Plate Count (mesófilos aerobios). Los resultados obtenidos a partir de las muestras analizadas permitieron obtener datos significativos relacionados con la ausencia/presencia de microorganismos patógenos antes y después del proceso de esterilización, así como el recuento de mesófilos, hongos y levaduras. En las muestras analizadas antes de la esterilización se encontraron microorganismos como: Citrobacter, Serrratia, Klebsiella, Staphylococcus, Clostridium y Pseudomonas. Algunos de ellos fueron encontrados en las muestras de Caléndula y Sen después de la esterilización con óxido de etileno.

Palabras clave: Plantas medicinales, análisis microbiológico, óxido de etileno.

Históricamente, los productos de origen vegetal, particularmente las plantas medicinales y sus extractos, han pasado de tener un papel de supremacía en el arsenal terapéutico a un discreto segundo plano, para volver a tener, en las dos últimas décadas, una presencia cada vez mayor en la terapéutica. Los remedios a base de plantas medicinales presentan una inmensa ventaja con respecto a los tratamientos químicos. En las plantas los principios activos se hallan siempre biológicamente equilibrados por la presencia de sustancias complementarias, que van a proporcionarse entre sí, de forma que, en general, no se acumulan en el organismo, y sus efectos indeseables están limitados. Sin embargo, a pesar de que han aumentado las investigaciones y estudios científicos de las plantas medicinales, todavía no se conocen muchos de los principios activos a los que deben las plantas sus extraordinarias cualidades.

Resaltando la importancia y el uso de las plantas medicinales, en la siguiente investigación, se planteó la necesidad de valorar su calidad; para ello se tuvo en cuenta el uso de herramientas como la esterilización con óxido de etileno, por lo que resultó este un producto de excelente calidad para la esterilización y el análisis microbiológico, que permite detectar la presencia de microorganismos patógenos o de microorganismos que alteren de tal manera, que lo hagan inadecuado para el consumo. De ahí surge la necesidad de conocer la calidad microbiológica de algunas de las materias primas propuestas para este estudio.

Métodos

Para realizar la toma de muestras, se tuvieron en cuenta algunos aspectos de carácter imprescindible que permitieran obtener información adecuada antes de proceder al análisis de las diferentes materias primas. En primer lugar el área de almacenamiento y las condiciones previas, para la adecuada manipulación. Según el manual de procedimientos y "control de calidad" interno de la compañía.1 ]]>
Para cada uno de los productos incluidos en la evaluación, se tiene una disposición por lote, lo que permitió tomar una porción (10 g) en cada uno de los 5 bultos de 25 kg que se tomaron por cada lote de producto. Los datos de control de temperatura y humedad relativa (HR), fueron tomados de las plantillas de control ubicadas en cada bodega.

Se tomaron muestras de 5 bultos con 25 kg de cada uno de los productos a evaluar y se colocaron sobre estibas. Tomando una sonda se recolectaron 10g aproximadamente, de los 5 bultos dispuestos por producto (fig.).

Fuente: Torres, 2006.
Fig. Toma de muestra.

Se realizó un pool de 50 g, de los cuales se tomaron 10 g y se llevaron a un envase tipo PEAD NAT (Induplas S.A), boca ancha debidamente rotulada (número de lote, orden de empaque, tipo de producto y presentación) y se procedió a homogenizar la muestra obtenida.
]]> Posteriormente ya en el laboratorio, se hizo la debida limpieza y desinfección del lugar de trabajo con hipoclorito al 2 % y a su vez se realizó la inspección, específicamente evitando cualquier entrada de aire que pudiera afectar los resultados del análisis.

Por cada producto, de acuerdo con su presentación se hizo el debido pesaje y posterior maceración si este lo requería. Ya procesadas cada una de las muestras, se dispusieron los 10g de cada una de las diferentes presentaciones en 90 mL de agua peptona estéril al 0,1 %; homogenizada cada una de las muestras 25 veces,2 posteriormente se filtraron con gasa estéril y se realizaron diluciones seriadas 102 y 103 a partir de la dilución 1/10.

De la dilución 1/10 se sembró a volumen de 1mL por duplicado en superficie, para cada una de las presentaciones de los productos en los medios indicados: TSN, EMB, Cetrimide, XLD y BP; posteriormente se llevó a incubar de acuerdo con las condiciones y temperatura requeridas por cada microorganismo. Con las diluciones seriadas mencionadas anteriormente, se sembraron por duplicado de cada una de ellas 1mL en profundidad, tanto para el medio OGY (hongos y levaduras), como para el medio Plate Count (aerobios mesófilos) y de igual manera se llevó a incubar como se mencionó anteriormente.3

Posterior a las condiciones adecuadas de crecimiento, se efectuaron los análisis correspondientes e interpretación para cada una de las materias primas, teniendo en cuenta los controles positivos siguientes: Pseudomonas aeruginosa CMDM 113, E. coli ATCC 8737 CMDM, Salmonella tiphymurium AMC, Staphylococcus salvaje CMDM 117, Clostridium perfringens ATCC 12915 y Penicillium sp. (Banco de cepas Pontificia Universidad Javeriana, 2006).

Resultados

Los resultados obtenidos durante la investigación permitieron determinar el límite microbiano en que se encontraron los productos, los que se compararon con los estándares permitidos y la presencia de algunos microorganismos pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae, mediante determinadas pruebas bioquímicas para cada una de las materias primas evaluadas antes y después del proceso de esterilización con óxido de etileno (EtO).

En los cuadros 1-5 se observan de manera detallada, los resultados de los microorganismos encontrados por producto, correspondientes al límite microbiano, recuento de mesófilos, hongos y levaduras previo y posterior del proceso con EtO, para cada uno de los productos.

Cuadro 4. Interpretación de resultados de Caléndula en flor y Caléndula en polvo posterior a la esterilización con EtO

Cuadro 5. Recuentos microbiológicos obtenidos posterior a la esterilización con EtO

DiscusiÓn

El análisis microbiológico de las plantas medicinales, para esta investigación, fue importante porque se logró observar y a su vez comparar, cómo la presencia de microorganismos pueden alterar de manera significativa la calidad del producto.

En cuanto a las condiciones de muestreo antes y después del proceso de esterilización con óxido de etileno, factores como el origen de las materias primas, temperatura y humedad relativa, determinaron los resultados que se encuentran consignados en las diferentes cuadros por producto.

El objetivo de cualquier proceso de esterilización, es destruir todos los microorganismos presentes en o sobre un objeto o preparación y asegurar que el producto esté libre de riesgos de infección.4 Los parámetros más importantes que se tuvieron en cuenta fueron: la temperatura de exposición, la concentración del gas, el tiempo de contacto y la humedad. Bajo estas condiciones, los resultados posteriores midieron el nivel de acción del gas que por su actividad y tamaño tiene la capacidad de actuar como agente alquilante, al reaccionar con los ácidos nucleicos y las proteínas funcionales, y provocar la muerte de microorganismos en lugares de difícil acceso.5

Para medir la eficacia del proceso, fue determinante conocer, si estas materias primas habían sido sometidas a procesos de secado, cuyo procedimiento consiste en la remoción de humedad a través del manejo de temperatura y por consiguiente, influye en la conservación del producto y en la efectividad de los principios activos y por lo tanto, en su calidad.6

Teniendo en cuenta lo anterior, se puede considerar que el material evaluado no tuvo un proceso de deshidratación adecuado, lo cual permitió que algunos microorganismos sobrevivieran y posteriormente se detectaran mediante los análisis microbiológicos realizados en el presente trabajo, corroborando lo expuesto por Atlas y Bartha en 2001 quienes postulan, que para un metabolismo activo, la mayoría de los microorganismos necesitan valores de aw por encima de 0,96, pero algunas bacterias, hongos y levaduras pueden crecer a valores de aw tan bajos como 0,60.7 ]]>
La posterior descripción microscópica y macroscópica, del crecimiento en los diferentes medios selectivos, determinaron la necesidad de comprobar por medio de algunas pruebas bioquímicas que microorganismos podían estar presentes, antes de someterse a la esterilización con oxido de etileno. La variedad de géneros y algunas especies indicaron no solo que el producto posiblemente tuvo deficiencias durante el secado, si no que a través de agentes externos como el empaque de procedencia, el almacenamiento, manipulación, temperatura, humedad relativa y otros se pudieron generar condiciones favorables de crecimiento y desarrollo de los microorganismos.

En estudios reportados por Argentina en el 2000, mostraron la alta contaminación microbiana en materias primas empleadas en la elaboración de productos medicinales de origen vegetal antes de su esterilización, de manera que se destaca la presencia de Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Salmonella sp.; igualmente otros autores han reportado la existencia de levaduras y hongos filamentosos detectando con frecuencia, Aspergillus y Penicillum (Artusi. L. Irradiación de Especias. Cámara Argentina de Especias. Seminario Ionización de Especias. Salón de Actos CNEA 2000) , hongos que de igual manera, se hicieron presentes durante esta evaluación; ahora bien con respecto a este último los recuentos de hongos y levaduras (OGY) y aerobios mesófilos obtenidos en general para las materias primas, aunque son altos antes de la esterilización, cabe anotar que estos se encuentran bajo los límites o estándares permitidos.8,9

Frente a la variedad de géneros encontrados de la familia Enterobacteriaceae, como Citrobacter, Serratia y Klebsiella, diferentes de los controles positivos (Escherichia coli y Salmonella sp., vale la pena resaltar que estos se encuentran en grandes cantidades en el ambiente (fuentes de agua, vegetación y suelos), no están asociados necesariamente con la contaminación fecal y no plantean ni representan un riesgo evidente para la salud.10 Sin embargo, las pruebas bioquímicas realizadas para los microorganismos encontrados tanto antes como después del procedimiento de esterilización, permitieron detectar presuntivamente algunas especies, que han sido reportadas como causantes de enfermedad en el hombre; por lo tanto, es importante tener mayor claridad en la posible causa de aparición de estos en las materias primas evaluadas.

Dentro de las especies encontradas, en primer lugar se tiene a Citrobacter diversus ha sido clasificado recientemente como una especie de Citrobacter, es frecuentemente un oportunista y como tal puede causar infecciones, en el tracto urinario, sinusitis, además de neumonía etc. Para el género Klebsiella las especies encontradas como K. ozaenae y K. oxytoca, estas pueden ser parte de la microbiota intestinal normal o presentarse como patógenos oportunistas causando infecciones crónicas. Finalmente, en el género Serratia fueron identificadas las especies siguientes: S. liquefancies y S. odorifera, se han aislado de tacto intestinal y se presentan como agentes oportunistas.11

Otro grupo detectado en las muestras evaluadas, está contemplada en los géneros de Pseudomonas y Clostridium. En cuanto a las especies del género Pseudomonas, Pseudomonas aeruginosa, se encuentra ampliamente distribuida en el suelo, agua, aguas negras y aire; se presenta frecuentemente en pequeña porción en la microbiota intestinal normal. Otras especies de Pseudomonas aparecen también en el medio ambiente pero rara vez producen enfermedad. Ps. aeruginosa es patógena solamente, cuando es introducida en zonas que carecen de las defensas normales o cuando participa en infecciones mixtas, como es el caso en pacientes quemados u hospitalizados.12 Mientras que las especies del género Clostridium, están ampliamente distribuidas en la naturaleza, principalmente en el suelo y en el tracto intestinal de muchas especies de animales, incluido el hombre y tienen la capacidad de producir potentes exotoxinas que son las responsables de ocasionar graves cuadros tóxicos.13 ]]>
Teniendo en cuenta algunas de las características de los géneros que se presentaron antes del procedimiento con EtO (óxido de etileno) y de acuerdo con los resultados presentados, permite considerar que factores como la procedencia, la recolección, los tipos de tratamiento, el transporte, la manipulación y el almacenamiento pudieron favorecer la presencia o el crecimiento microbiano.

Aunque los productos de origen vegetal suelen contener un elevado número de bacterias y hongos, son las condiciones en que se recolectan las que favorecen una contaminación abundante y el crecimiento de microorganismos diversos, aunque esta suele disminuir mediante un tratamiento de secado.14 Para este caso se detectaron bacterias no esporuladas, microorganismos indicadores y algunos patógenos, sin embargo, la posibilidad de considerar puntos de contaminación específicos, solo podría detectarse evaluando aquellos sitios de mayor acceso contemplados en el diagrama de procedimientos para el manejo de los productos naturales.

De los patógenos que sirvieron como controles positivos, el único detectado antes del proceso de esterilización en las diferentes presentaciones de las materias primas analizadas fue Staphylococcus aureus, quien indica posiblemente la falta de limpieza y desinfección, ya sea en superficies, equipos, o contacto con los manipuladores. A pesar de haber encontrado S. aureus, este presentó susceptibilidad al óxido de etileno, lo que indica que se puede destruir fácilmente por tratamientos térmicos o por otro tipo de agentes.15

En cuanto a la presencia de hongos y levaduras, estos posiblemente pudieron desarrollarse durante el almacenamiento y el transporte, algunos de ellos fueron identificados como: Penicillum sp., Aspergillus sp. y Mucor sp.; en cuanto a levaduras la presencia de Rhodotorula sp. y finalmente la presencia de un actino como Streptomyces sp., este microorganismo es parecido a los hongos, pero actualmente es considerado como bacteria filamentosa. Tiene una amplia distribución mundial en los suelos, resulta de gran importancia en la descomposición aerobia de los compuestos orgánicos y tiene un rol importante en el ciclo del carbono.

La aparición de un hongo o levadura, generalmente está regulada por condiciones ambientales. Ahora bien el proceso de esterilización trajo consigo minimizar o reducir la población de microorganismos de manera significativa como en el caso del Boldo en hojas y en polvo, sin embargo algunos reincidieron para el caso del Sen en polvo, Fucus entero, Caléndula en flor y Caléndula en polvo, valor que correspondería al 50 % del total de productos esterilizados, teniendo en cuenta que la Spirulina maxima no se esteriliza, lo que indica que los resultados encontrados en esta investigación permitieron que el 50 % restante de las materias primas, presentaran sensibilidad frente al EtO (Rubio, T. Principios básicos que fundamentan la irradiación de alimentos. Seminario para el Sector Salud Proyecto ARCAL XXIX: Desarrollo de la irradiación de alimentos en países del Cono Sur. Seminario, Buenos Aires Argentina, 1998 b). Estos resultados sugieren determinar mediante un sistema de análisis de peligros y puntos críticos de control (HACCP), en que parte del manejo que se le da a estos productos, se encuentra la posible fuente de contaminación. Frente a las deficiencias en la calidad microbiológica como lo reportara Arias en 1999, muestran la importancia de desarrollar reglamentos con respecto a los controles que deben efectuarse a estas, de manera que no representen un riesgo para la salud del consumidor. ]]>
Para el caso de Spirulina maxima en el cuadro de resultados, la presencia de microorganismos ya descritos con anterioridad, son preocupantes, ya que este producto no se somete a proceso de esterilización, debido a que no requiere transformación de tipo físico, pues su compra se hace directamente en polvo y a su vez la comercialización.

Sobre la base en los resultados obtenidos, se deduce que las muestras de estos productos analizados, presentaron una carga microbiana que pudo ser reducida, la cual se encontró incluso por debajo del rango permitido dentro de los estándares nacionales como internacionales de calidad, lo que indica la eficiencia del gas teniendo en cuenta su buen manejo, en cuanto a la concentración, la humedad, el tiempo de contacto y demás características que lo hacen viable a pesar de su uso restringido desde el año 1990 en países europeos, por tanto lo hace muy eficiente y viable para el uso comercial de estas materias primas.

Para la empresa, el haber llevado a cabo esta investigación, permitió conocer en que estado se encuentran algunas de las materias primas evaluadas a nivel microbiológico, la eficiencia de la esterilización con óxido de etileno y las posibles deficiencias que se están presentando a nivel de procesos internos.

Para la compañía es el comienzo de un trabajo dentro de la línea de plantas medicinales, que permitirá mejorar y a su vez estandarizar las directrices para el adecuado manejo de sus productos y a su vez garantizar, la inocuidad de estos.

sUMMARY

Microbiologic analysis of medicinal plants using ethylene oxide

From prehistoric times, use of curative plants is one of the more ancient and widespread medical therapies, (Wust, 2003). Each culture has developed its folk medicine traditions, with remedies and rituals using native plants. Health World Organization (HWO), by means of some statements, has expressed its role as for need to assess use of medicinal plants within health scope, considering that 80% of world population depend on these ones as for health primary care (Alonso, 1998). In face of this need, and on concern about supply of high quality products, research performed allow us to assess some of raw materials, e.g.: Boldo (Pneumus boldus), Calédula (Calendula officinalis), Sen (Casia angustifolia Vahl), Fucus ( Fucus vesiculosas L), and Spirulina (Spirulina maxima), with a high demmand in market. Aim of this study was to assess microbiologic quality, and to establish if sterilization process using ethylene oxide had an significative effect on the raw material to be assessed. Authors made a count of aerobe mesophile microorganismes, fungi, yeasts, and absence/presence tests for pathogen microorganisms like Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella s.p., Clostridium perfringes, and Staphylococcus aureus. These test were performed using specific culture media: TNS, EMB, CETRIMIDE, XLD, B.P., OGY (fungi and yeasts), and Plate Count (aerobe mesophiles). Results from study samples allows us to obtain significant data, related to sterilization, as well as the mesophile, fungi, yeasts count. In above samples, befor sterilization, we found microorganisms like: Citrobacter, Serratia, Klebsiella, Staphyulococcus, Clostridium, and Pseudomonas. Some were found in Caléndula and Sen samples after sterilization using Ethilene oxide.

Key words: Medicinal plants, microbiologic analysis, ethilene oxide. ]]>

Referencias bibliográficas

1Microbióloga Industrial.
2Master en Ciencias. Bacteriólogo. ]]> 1. 2. OMS. 1998 . 3. INVIMA. 2005 125 4 1999 7 ene.-feb. ene.-feb. 1-11 5. 6. 2003 . 7. 2001 307-10 8. 2000 . 9. 1996 10. 2001 5 ed. 11. 1979 242. 12. 13. 2 ed. 14. 1991 . 6 ed. 15 1991 223 223 57-8