ARTÍCULOS ORIGINALES
Influencia de los parámetros de secado sobre los indicadores fisico-químicos y biológicos de un hidrolizado de proteínas
Influence of the drying parameters on the physicochemical and biological indicators of a protein hydrolisate
]]>
Raisa ZhurbenkoI; Claudio Rodríguez MartínezII; Tamara Lobaina RodríguezIII; Vivian de Jesús Quesada MuñizIV; Esther Díaz BlancoV; Orestes Darío López HernándezVI
I Doctora en Ciencias de los Alimentos. Ingeniera Tecnóloga. Investigadora Titular. Departamento de Investigaciones de Medios de Cultivo. Centro Nacional de Biopreparados. La Habana, Cuba.
II Doctor en Ciencias Técnicas. Ingeniero Tecnólogo. Investigador Titular. Centro Nacional de Biopreparados. La Habana, Cuba.
III Master en Ciencias. Ingeniera. Investigadora Agregada. Departamento de Investigaciones de Medios de Cultivo. Centro Nacional de Biopreparados. La Habana, Cuba.
IV Master en Ciencias, Licenciada en Ciencias Farmacéuticas, Investigadora Auxiliar. Departamento de Ventas, Centro Nacional de Biopreparados. La Habana, Cuba.
V Master en Ciencias, Licenciada en Ciencias Farmacéuticas, Departamento de Documentación, Centro Nacional de Biopreparados. La Habana, Cuba.
VI Ingeniero Químico, Departamento de Formas Terminadas, Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos (CIDEM). La Habana, Cuba.
RESUMEN
Se estudiaron las condiciones de la deshidratación por aspersión de un hidrolizado papaínico proveniente del músculo animal, y se demostró que el parámetro de mayor influencia directa sobre la densidad aparente del polvo resultó la concentración de sólidos totales (43 %), seguidamente de la temperatura en la entrada de la cámara (140 °C) y velocidad del atomizador (21 500 rev/min), ambos de forma inversa. La densidad aparente alcanzó aproximadamente 400 kg m-3 en comparación con la obtenida antes del estudio de 50 kg m-3. Se comprobó que mejores resultados, en cuanto a la densidad aparente, se obtuvieron al deshidratar el hidrolizado a 122 °C en la entrada de la máquina y 90 °C en la salida en comparación con 140 °C en la entrada del equipo. Se demostró que el producto obtenido posee características físico-químicas y bioquímicas favorecedoras del crecimiento de diferentes especies microbianas de colección.
Palabras clave: Densidad aparente, secado por aspersión, hidrolizado papaínico, nitrógeno total, nitrógeno amínico, promoción del crecimiento microbiano.
ABSTRACT
The spraying dehydration conditions of a Papaic hydrolisate from an animal muscle were studied, and it was proved that the parameter with the highest direct influence on the apparent density of the powder was the concentration of total solids (43 %), followed by the temperature at the inlet of the chamber (140 °C) and the speed of the atomizer (21 500 rev/min), both in an inverse form. The apparent density reached approximately 400 kg m-3 compared with the obtained before the study of 50 kg m-3. As to the apparent density, better results were obtained on dehydrating the hidrolisate at 122 °C in the inlet of the machine and at 90 °C in the outlet, in comparison with 140 °C in the inlet of the equipment. It was proved that the product obtained had physical, chemical and biochemical characteristics that favored the growth of different microbial species of collection.
Key words: Apparent density, spray drying, papaic hydrolysate, total nitrogen, amino nitrogen, promotion of the microbial growth.
]]>
INTRODUCCIÓN
Los hidrolizados obtenidos a partir del músculo animal se utilizan ampliamente como componentes fundamentales en los medios de cultivo para microbiología, así como en los procesos industriales de fermentación en las industrias farmacéutica y biotecnológica.1,2
La etapa final en la producción de hidrolizados es el proceso de secado por aspersión. En esta fase es común obtener los productos con la densidad aparente baja. Es por ello que entre los atributos de calidad que se evalúan al producto final en polvo, la densidad aparente se considera como parámetro crítico, la cual depende de las condiciones del secado por atomización. Por ejemplo, la baja concentración de sólidos totales en el hidrolizado líquido sometido a secado proporciona el incremento de la capacidad espumante en el polvo rehidratado y, por consecuente, este hidrolizado resulta no apropiado para los procesos de fermentación.3
Otros parámetros han mostrado su influencia crítica en la densidad aparente de los polvos. Ellos son: el diseño especial de los discos de atomización para reducir el volumen del aire atrapado e introducido con el bombeo de la solución del producto a secar, la disminución de la temperatura del aire en la salida con el consecuente aumento de la humedad residual y la reducción del volumen del aire en la entrada de la máquina deshidratadora.4
Por otra parte, se han usado ampliamente los diseños experimentales para la optimización de la composición de los medios y también para el estudio de la influencia de diferentes parámetros tecnológicos sobre las características del producto.1,2,5
Teniendo en cuenta el efecto de parámetros operacionales sobre la densidad aparente, el objetivo del presente trabajo consistió en el estudio de la influencia de la temperatura de aire en la entrada de la máquina deshidratadora, la concentración de sólidos totales y velocidad del atomizador sobre la densidad aparente del polvo y otros indicadores fisico-químicos y biológicos del hidrolizado de proteínas del músculo animal.
MÉTODOS ]]>
Diseño experimental: Se realizó el estudio de la influencia de 3 parámetros tecnológicos en el proceso de secado por aspersión a escala piloto (Niro Atomizar, Dinamarca): la concentración de sólidos totales, la velocidad del atomizador y la temperatura del aire en la entrada de la máquina deshidratadora. Como variable respuesta fue seleccionada la densidad aparente del polvo. Las experiencias se realizaron mediante un diseño experimental completamente aleatorizado según un plan factorial 23 (tabla 1), repitiendo este 3 veces y ejecutando cada determinación por triplicado (n= 9).6Teniendo en cuenta los resultados de este previo diseño experimental, fueron sometidas al secado 2 porciones del concentrado de un lote industrial del hidrolizado a 140 °C (A) y 122 °C (B) de temperatura del aire en la entrada del equipo y 90 °C en la salida en un secador por pulverización SD-12,5-CR (Dinamarca). La temperatura de 122 °C es el nivel mínimo con el cual se garantiza la temperatura del aire 90 °C en la salida de la máquina. Se aplicó el resto de las variables resultantes del diseño experimental aplicado con la anterioridad.
Densidad aparente del polvo: Se determinó con la utilización de 6 recipientes de aluminio de forma cilíndrica, a los cuales, previamente, se les halló su volumen (n= 3), calculando el valor promedio para cada uno de ellos.7 La densidad aparente fue calculada relacionando el peso del polvo con el volumen del recipiente y expresada en kg m-3.8
Análisis físico-químico: El contenido de nitrógeno amínico se determinó por el método potenciométrico en presencia de formaldehído9,10 (PHM 83 AUTOCAL, Radiometer, Dinamarca); de nitrógeno total por el método de Kjeldahl, con la ayuda del sistema automático Kjeltec System Tecator (Suecia);11 relación nitrógeno amínico/nitrógeno total; pérdida por desecación por el método gravimétrico;12 contenido de cloruros, como cloruro de sodio, por el método de Volhard.12 Valores de pH fueron determinados a una solución al 2 % (p/p) después de la esterilización en autoclave (Sakura, Japón) a 121 °C por 15 min por el método potenciométrico (PHM 83 AUTOCAL, Radiometer, Dinamarca).12
Reactividad biológica: La detección de gas sulfhídrico, producción de indol, presencia de carbohidratos fermentables y producción de acetilmetilcarbinol (prueba de Voges-Proskauer) se determinaron según recomienda la Farmacopoeia USP 27.13
Preparación de los medios de cultivo: La evaluación del desempeño del hidrolizado obtenido fue evaluada en el medio de cultivo agar desoxicolato:14 peptona bacteriológica 10,0 g l-1, lactosa 10,0 g l-1, desoxicolato de sodio 1,0 g l-1, citrato férrico 1,0 g l-1, citrato de sodio 1,0 g l-1, fosfato dipotásico 2,0 g l-1, cloruro de sodio 5,0 g l-1, rojo neutro 0,03 g l-1 y agar 15 g l-1).
Materiales de referencia y cepas microbianas: Se utilizó la peptona bacteriológica de OXOID (Inglaterra). Como formulación de referencia fue utilizado el agar desoxicolato, con la inclusión en su formulación de la peptona bacteriológica de OXOID (Inglaterra).14
Para los ensayos específicos en los medios de cultivo fueron utilizadas cepas microbianas de American Type Culture Collection (ATCC): Escherichia coli 25922, Enterobacter aerogenes 13048, Enterococcus faecalis 19433, Salmonella typhimurium 14028, Staphylococcus aureus 25923 y Salmonella typhi 19430.
Los inóculos se prepararon partiendo de los cultivos frescos de los microorganismos de referencia tomados de la superficie inclinada de agar triptona soya (BioCen).14 Las muestras de los microorganismos se traspasaron a los tubos de ensayo con la solución salina estéril al 0,85 % (p/v) (NaCl, grado analítico; Merck, Alemania). Las suspensiones microbianas se homogeneizaron en el agitador de tubos. La concentración de células microbianas se ajustó adicionando solución salina estéril al 50 % de transmitancia a 580 nm (espectrofotómetro PU 8620 UV-vis PHILIPS, Inglaterra), correspondiendo aproximadamente a 3,0 x 108 células/mL. Posteriormente se prepararon diluciones decimales seriadas, las cuales se inocularon en los medios de cultivo en dependencia de la capacidad de promover el crecimiento microbiano. Los recuentos se expresaron en unidades formadoras de colonias (UFC) por mililitro.15
Tratamiento estadístico: A todos los valores de los parámetros físico-químicos se calculó la desviación estándar. Con los resultados obtenidos en el diseño experimental 23 se procedió a adaptar el siguiente polinomio:6 ]]>
y= b0 + b1 x1 + b2 x2 +b3 x3 +b1 2 x1 x2 +b2 3 x2 x3 +b1 3 x1 x3 +b1 2 3 x1 x2 x3
Los coeficientes "bn" se calcularon mediante el sistema matricial:
B= (X'X)-1X'Y
donde:
Y: matriz de los resultados experimentales.
X: matriz de las variables independientes.
Su significancia para p < 0,5 se determinó mediante la prueba da la t de Student. La adecuación del modelo se detectó mediante la prueba de Fisher. En los casos requeridos se empleó la prueba de rangos múltiples de Duncan (p < 0,05). Para todo el tratamiento estadístico se empleó el paquete estadístico "Statistica6", de StatSoft, Inc. (EE.UU.). ]]>
RESULTADOS
La figura (a, b y c) muestra los resultados de la influencia de la concentración de sólidos totales, la temperatura del aire en la entrada de la cámara y velocidad del atomizador sobre la densidad aparente del polvo. Ellos permitieron determinar que el parámetro de mayor influencia sobre la densidad aparente del polvo resultó ser la primera variable independiente que es la concentración de sólidos totales (43 %). Seguidamente se ubican en orden la tercera variable independiente que es la temperatura en la entrada de la cámara (140 °C) y la velocidad del atomizador (21 500 rev/min). Estas 2 últimas variables tienen una relación inversa con respecto a la densidad aparente.
Como resultado del análisis estadístico de los resultados, se obtuvo la siguiente ecuación de regresión:
y= 343 + 38x1 - 13x2 - 22x3 + 8x1x3 _ 5,9x1x2x3.
El valor de la prueba de Fisher calculado para analizar la adecuación del modelo resultó F= 1,23, lo que resultó menor de Fisher de la tabla (F= 2,7), con esto se comprobó la adecuación del modelo. El diagrama de Pareto (figura 1c) de los efectos estandarizados corrobora las conclusiones previas sobre la influencia de diferentes factores sobre la densidad aparente de acuerdo con el modelo estudiado.
Como resultado de este estudio se puede concluir que se alcanzó un valor de la densidad aparente del hidrolizado de 403,1 ± 28,6 kg m-3, lo que resultó significativamente superior al valor de 53,5 kg m-3, obtenido previamente.
A escala industrial se obtuvieron los siguientes valores de la densidad aparente para las variantes A y B respectivamente: 210,36 ± 1,08 y 240,69 ± 4,06 kg m-3, se detectó diferencia significativa para p < 0,05. El aumento de la densidad aparente del hidrolizado en la variante B correspondió a lo demostrado en el diseño experimental, que el aumento de la densidad aparente del hidrolizado es directamente proporcional a la disminución de la temperatura en la entrada a la máquina deshidratadora. Se logró un significativo aumento de la densidad aparente del polvo (240,69 ± 4,06 kg m-3) en el proceso industrial en comparación con el valor de la densidad aparente obtenida previamente a la realización del diseño experimental (53,5 ± 1,1 kg m-3).
En la tabla 2 se resumen los resultados obtenidos en la evaluación físico-química del producto obtenido a escala industrial. Como se puede observar (tabla 2), todos los valores de los índices estudiados se encuentran en el rango establecido en la especificación del hidrolizado de tejido animal en BioCen, lo que demuestra que la aplicación de los parámetros derivados del estudio de secado realizado garantizan los indicadores de la calidad del producto a escala industrial. ]]>
En la tabla 3 se muestran los resultados de la reactividad biológica del hidrolizado obtenido a escala industrial en comparación con la peptona bacteriológica de OXOID (Inglaterra) y el requisito de calidad establecido en BioCen.Como se puede observar en la tabla 3, la prueba de gas sulfhídrico resultó positiva para Salmonella typhimurium, lo que demostró con esto la presencia de los aminoácidos sulfurados en la composición de la base nutritiva evaluada. Fue demostrada, mediante esta prueba, la producción de indol frente Escherichia coli (control positivo), con resultados negativos la respuesta para Enterobacter aerogenes. Resultó positiva también la prueba de acetilmetilcarbinol para Enterobacter aerogenes y negativa para Escherichia coli. Estas 3 pruebas cumplieron con el requisito establecido para el producto en BioCen y resultaron similares para la peptona bacteriológica de OXOID (Inglaterra), utilizada en calidad de producto de referencia.
En la determinación de carbohidratos fermentables (tabla 3), se observó una ligera producción de gas por Escherichia coli (control positivo), resultado este contemplado en las especificaciones del producto (BioCen). No ocurrió cambio de coloración, es decir, no hubo producción de ácido. El control negativo (Enterococcus faecalis) mostró los resultados esperados.
La tabla 4 recoge los resultados de la evaluación del desempeño del hidrolizado del músculo animal en calidad de peptona bacteriológica en el medio agar desoxicolato.
No hubo diferencia significativa para p< 0,05 entre los recuentos obtenidos para Escherichia coli ATCC 25922 y Salmonella typhi ATCC 19430 en los medios de cultivo comparados. El crecimiento de Staphylococcus aureus ATCC 25923 resultó totalmente inhibo en ambas variantes del medio de cultivo.
Los resultados globales de las pruebas comparativas del hidrolizado papaínico de tejido animal obtenido a escala industrial con los nuevos parámetros operacionales en el proceso de secado y producto de referencia comercial demostraron la similitud en la capacidad de promoción del crecimiento microbiano y las características diferenciales del medio específico.
DISCUSIÓN
El hallazgo de la mayor influencia de la variable concentración de sólidos totales sobre la densidad aparente del polvo coincide con lo planteado por Bridson y Brecker16 y Bridson,17 los que recomiendan llevar la concentración de sólidos totales del hidrolizado antes de su deshidratación hasta aproximadamente 67 %, el punto de sirope. Los resultados de varios estudios describen el efecto de diferentes parámetros operacionales sobre la densidad aparente, lo cual demuestra que este indicador se incrementa con el aumento de la concentración de sólidos totales. Así, por ejemplo, Brown3 define la densidad aparente como la masa total del producto correspondiente a una unidad de volumen ocupado por el material y destaca que esta varía con la distribución de tamaño de partículas y con la porosidad de éstas. El aumento de la velocidad de la atomización incrementa la humedad residual del polvo y el rendimiento del producto más denso. ]]>
La influencia de las combinaciones de las 3 variables es difícilmente interpretable, lo que coincide con lo reportado por López Planes6 y Grachiev,18 además, los valores absolutos de los coeficientes de la ecuación de regresión obtenida para las combinaciones de las variables no representan interés práctico.Con el compendio de los resultados obtenidos en esta fase, se definen las siguientes recomendaciones para el proceso industrial de elaboración del hidrolizado: disminuir, hasta mínimo permisible, la temperatura en la entrada de la máquina de secado por aspersión, manteniendo constante de la temperatura del aire en la salida del equipo; lograr la concentración máxima de sólidos totales y garantizar la mínima velocidad de atomización. Estos resultados fueron aplicados a la producción a escala industrial del hidrolizado papaínico del tejido animal, y se corroboró la hipótesis planteada.
Como parte de la evaluación del desempeño del hidrolizado, se demostró que este producto posee los nutrientes necesarios para el cultivo de los microorganismos como los aminoácidos esenciales (triptófano y los sulfurados), así como la prácticamente total ausencia de carbohidratos fermentables, los requisitos establecidos por la USP 27.13
El comportamiento del digerido papaínico obtenido a escala industrial en el agar desoxicolato, medio diferencial para el aislamiento de bacterias coliformes y ligeramente selectivo para el aislamiento de patógenos entéricos, evidenció que la misma es capaz de promover el crecimiento microbiano aun a altas diluciones del inóculo empleado (3 ´ 102 UFC/mL), lo que coincide con el control de la calidad de este medio de cultivo por la firma Merck (Alemania).19
Los parámetros, clasificados como "parámetros no operacionales", como el diseño especial de la cámara de secado, con el flujo de alimentación en contracorriente, el uso de los aditivos para la disminución del efecto electrostático y el uso de los dispersantes en la alimentación, como polietilenglicol, alcohol polivinílico y metilcelulosa, pueden ejercer determinada influencia sobre la densidad aparente de los polvos obtenidos por el secado por aspersión.20 Ove,21 por ejemplo, patentó un método que describe el uso de la maltodextrina e hidroxipropil metil celulosa para la obtención de polvos secados por aspersión con la elevada densidad aparente. Dada la importancia de la densidad aparente de los medios de cultivo y otros productos farmacéuticos, es conveniente realizar otros estudios encaminados en el aumento, aun en mayor grado, de este indicador.
RECOMENDACIONES
Estudiar la influencia de los dispersantes sobre la densidad aparente del hidrolizado papaínico del músculo animal.
]]>
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Adinarayana K, Ellaiah P. Response surface optimization of the critical medium components for the production of alkaline protease by a newly isolated Bacillus sp. J Pharm Pharm Sci. 2002;5(3):272-8.
2. Sumant P, Qasim Khalil B, Rani G. Optimization of Alkaline Protease Production from Bacillus sp. by Response Surface Methodology. Curr Microbiol. 2002;44:286-90.
3. Brown GG. Operaciones básicas de la ingeniería química. La Habana: Edición Revolucionaria; 1990. p. 586-90.
4. Treybal RE. Operaciones con transferencia de masa. La Habana: Edición Revolucionaria; 1997. p. 697-700.
5. Gabdrakhmanova LA, Balaban NP, Sharipova MR, Tokmakova IuS, Sokolova EA, Rudenskaia GN, et al. Optimization of cultivation medium for the production of Bacillus intermedius 3-19 glutamyl endopeptidase. Mikrobiologia. 2002;71(3):323-9.
6. López Planes R. Diseño estadístico de experimentos. Coedición de la Universidad Autónoma de Yucatán y la Universidad de La Habana, 1994. p. 1-50.
7. Zhurbenko R. Metodología para el aprovechamiento de los subproductos de la industria alimenticia y otras proteínas en la evaluación de la calidad sanitaria de los alimentos (Tesis doctoral). La Habana: Universidad de La Habana; 2005. 125 pp.
8. German RM. Density Conversion Table. 1997. Available from: URL: http://www.reade.com/Particle Briefings/density_table.html
9. Guadix A, Guadix EM, Páez-Dueñas MP, González-Tello P, Camacho F. Procesos tecnológicos y métodos de control en la hidrólisis de proteínas. Ars Farmacéutica. 2000;41(1):79-89.
10. Morris Quevedo HJ, Almarales Arceo A, Romero Viamonte K, Vidal Colás M. Validación de un método potenciométrico para la determinación de nitrógeno amínico en hidrolizados proteicos de microalgas. Rev Cubana Farm. 2002;36(1):56-61.
11. Tecator. Determination of Kjeldahl nitrogen content with Kjeltec System 1026. Application Note. Sweden, 1987.
12. Runova VF, Bendas LG, Maksimova GA, Preobrazhenskaya EI, Raskin BM, Mielnikov VA. Mietodicheskie ukazania po primienieniyu fiziko-khimicheskikh mietodov kontrolia pitatielnikh sried. Moscú: 1977. p. 5-10.
13. USP 27-NF-22. The United States Pharmacopeia. Twenty Seventh Revision. The National Formulary Twenty second edition en CD-ROM User Guide. Reagents. Pancreatic Digest of Casein [monografía en CD-ROM]. United Pharmacopoeial Convention, Inc. Rockville: Staff Liaison; 2004.
14. Rodríguez Martínez C, Zhurbenko R, Quesada Muñiz VJ, Lobaina Rodríguez T, Tsoraeva A, Díaz Pérez M, et al. Manual de medios de cultivo. 3ra ed. La Habana: BioCen; 2004. 264 pp.
15. ISO 6887-1. Microbiology of food and animal feeding stuffs-Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination-Part 1: General rules for the preparation of the initial suspension and decimal dilution. 1999.
16. Bridson EY, Brecker A. Design and Formulation of Microbial Culture Media. En: Norris JR, Ribbons DW, eds. Methods in Microbiology. vol 5B. London and New York: Academic Press; 1970. p. 235.
17. Bridson EY. The development, manufacture and control of microbiological culture media. UK: Unipath Ltd; 1994. p. 12.
18. Grachiev YP. Matiematicheskie mietodi planirovania eksperimientov. Moskva: Pischevaia promishliennost; 1979. p. 40-63.
19. Merck Microbiology Manual. 12th ed. Darmstadt: Merck, 2006. p. 253-4.
20. Masters K. Spray drying Handbook. 5. ed. Singapore: Longman Scientific and Technical; 1991. p. 345-7.
21. Ove EH, inventor; Niro AS US, assignee. Method of spray drying. US patent 6,253,463. 2001.
Recibido: 9 de noviembre de 2007.
Aprobado: 10 de diciembre de 2007.
Dra. C. Raisa Zhurbenko. Centro Nacional de Biopreparados (BioCen). Apartado 6 048, Habana 6, CP 32 600, La Habana, Cuba. Correo electrónico: raisa@biocen.cu ]]>
]]>
