ARTÍCULOS ORIGINALES

Validación de la técnica de determinación del nitrógeno amínico al trofin en su forma líquida

Validation of the amino nitrogen determination technique to trophin in its liquid form

Maritza González Pérez^I; Yunier Domínguez Reyes^II; Yuriam Reyes Peña^III; Raúl González Hernández^IV ]]> ^I Licenciada en Microbiología. Centro Nacional de Biopreparados. La Habana, Cuba. Correo electrónico: maritzaglez@biocen.cu
^II Técnico Medio en Veterinaria. Centro Nacional de Biopreparados. La Habana, Cuba.
^III Licenciado en Bioquímica. Centro Nacional de Biopreparados. La Habana, Cuba.
^IV Doctor en Ciencias Biológicas. Centro Nacional de Biopreparados. La Habana, Cuba.

RESUMEN

El presente trabajo tuvo como objetivo la validación de la técnica de determinación del nitrógeno por el método de titulación, la que se emplea en la cuantificación de este componente en el antinémico y reconstituyente trofin. Se preparó una curva patrón con un medio de cultivo de concentración de nitrógeno amínico conocida para determinar la linealidad del patrón, y se comparó con el de la muestra mediante un análisis de regresión. Se realizaron los estudios de exactitud donde no existieron diferencias significativas entre R y el 100 % para p > 0,05; en la repetibilidad se cumplió que el coeficiente de variación es menor que el 5 %; en la especificidad no se encontraron diferencias significativas para una p > 0,05 entre la sumatoria del nitrógeno amínico de la mezcla de las materias primas y del trofin; en la precisión intermedia resultó que el coeficiente de variación es menor que el 10 % y en cuanto al rango de ensayo se cumplió para las concentraciones de nitrógeno amínico ³ 0,07 que es el rango de trabajo de la especificación de calidad para el trofin.

Palabras clave: Validación, nitrógeno amínico, trofin.

The objective of this paper was to validate the nitrogen determination technique by the titering method, which is used in the quantification of this component in the antianemic and tonic trophin. A pattern curve was prepared with a known concentration culture medium of amino nitrogen to determine the linearity of the pattern and it was compared with that of the sample by regression analysis. Accuracy studies were conducted and no significant differences were found between R and the 100 % for S p > 0.05; in the repeatability, it was observed that the coefficient of variation was lower that 5 %; whereas in the specificity no marked differences were detected for p > 0.05 between the addition of the amino nitrogen of the mixture of raw materials and trophin. The variation coefficient was under 10 % in the intermediate precision. As regards the assay range, the amino nitrogen concentrations were 0.07, which is the working range of the quality specification for trophin.

Key words: Validation, amino nitrogen, trophin.

INTRODUCCIÓN

El trofín es un producto de origen natural, constituido por miel de abejas, sangre bovina y material enzimático, a base de pepsina obtenida del abomaso bovino, así como benzoato de sodio y propóleos como preservantes.¹

El nitrógeno componente elemental de las proteínas, los ácidos nucleicos y de otras biomoléculas importantes se haya presente también en el producto trofin, aportado por la sangre bovina que es una de las materias primas que compone este producto, una vez que la sangre es hidrolizada por el complejo enzimático que se utiliza durante el proceso de elaboración de este queda expuesto al medio, el nitrógeno amínico, el cual da la medida del grado de hidrólisis ocurrido² y es un parámetro que se mide dentro de las Especificaciones de Calidad que se exigen por Aseguramiento de la Calidad (PNO-01.369-Análisis fisicoquímico del producto trofin, BioCen. ]]> Para dar cumplimiento a los requisitos exigidos en las ISO-9001 del 2000 se hizo necesario validar la técnica de determinación del nitrógeno amínico (VAL 1 07 .01-Protocolo maestro de validación de métodos analíticos BioCen) mediante experimentos que permitan demostrar la especificidad, exactitud, linealidad, precisión y rango del método empleado, con la utilización de muestras de cada una de las materias primas por separado, así como del producto final elaborado con estos mismos ingredientes.^3-7

El programa utilizado para el procesamiento estadístico fue el Statgraphics Versión 5.1. con el cual se realizaron todas las determinaciones estadísticas correspondientes.

Equipos, materias primas y reactivos

- Equipos: balanza universal Sartorius, balanza analítica Sartorius, agitador magnético Corning, agitador magnético Retomed, pHM 92 LabMeter, pHM 240 ión Meter. y Pipet-aid.
- Materias primas: trofín, miel de abejas, extracto acuoso abomasal, propóleo, benzoato de sodio, sangre y triptona
- Reactivos: hidróxido de sodio 0,1 N, ácido clorhídrico 0,1 N, formaldehído al 37 %, agua destilada y agua desionizada de calidad reactiva.

Preparación de las muestras y soluciones ]]> Se tomaron muestras de las materias primas en diferentes combinaciones, pero siempre en las proporciones en que son empleadas para fabricar el producto final (trofin), así como del producto terminado.

Muestra 1: trofin del lote 510 en la cantidad de 300 mL.
Muestra 2: material hidrolizante.
Muestra 3: benzoato de sodio.
Muestra 4: material hidrolizante más miel de abejas más propóleos.
Muestra 5: material hidrolizante más miel de abejas más propóleos más benzoato de sodio.
Solución de hidróxido de sodio al 0,1 N.

Técnica para determinación del nitrógeno amínico ]]> Se empleó la técnica de titulación. Los equipos utilizados fueron: medidor de pH (PHM-83 Radiometer) , agitador magnético (IKAMAG REO ) y bureta de pistón de 20 mL (T-80 Schott). Reactivos: formaldehído p.a. al 37 % (Merk), hidróxido de sodio p.a.al 0,1 N (Merk), etanol, fenoftaleína al 1 % (BDH), rojo de metilo al 0,1 % (BDH), Tris hidroximetil aminometano, bisulfito de sodio p.a. (Merk) y ácido clorhídrico puris en solución 0,1 N (Merk). Se tomaron 3 mL de la muestra completándose hasta 20 mL con agua destilada y se sometió a la titulación con hidróxido de sodio. Los resultados se expresaron en g por 100 mL de la muestra.

Para el procesamiento estadístico de los datos se empleó el programa Statgraphics Versión 5.1.

Operaciones preliminares

Preparación de las muestras. Las muestras de material enzimático (ABM); de benzoato de sodio, de ABM más miel de abejas más propóleos y de ABM más miel de abejas más propóleos más benzoato de sodio, se prepararon en la misma proporción que para la preparación del producto trofin según PNO- 04.014 "Proceso tecnológico de obtención del producto trofin" de BioCen.y se guardaron en frascos estériles con tapa de rosca en refrigeración de 2 a 8 °C hasta su uso.

Preparación de la muestra de trofin. Se tomó una muestra de 300 mL del lote-510 de trofin que se preparó en el laboratorio según PNO-04.014 "Proceso tecnológico de obtención del producto trofin" de BioCen y se guardó en frasco estéril tapa de rosca en refrigeración de 2 a 8 °C hasta su uso.

Preparación de la muestra de sangre bovina. Se utilizó el mismo lote de sangre bovina que en la preparación del lote-510 en la misma proporción según PNO-04.014 "Proceso tecnológico de obtención del producto trofin" y se guardó en frasco estéril tapa de rosca en refrigeración de 2 a 8 °C hasta su uso.

Preparación de soluciones. La preparación de la solución de NaOH 0,1N se realizó según se describe en el PNO-10.007 "Preparación de las soluciones de NaOH" de BioCen.

La preparación de la solución de HCl-0,1N se realizó según se describe en el PNO-10.004 "Preparación de soluciones de ácido clorhídrico" de BioCen.

Descripción de la técnica analítica. La técnica de la valoración para la determinación de nitrógeno amínico al producto trofín se describe en el PNO 01.369 "Análisis físico- químico del producto trofín" de BioCen. ]]>
Procesamiento

La técnica a validar incluyó los siguientes experimentos:

1. Determinar la especificidad, mediante la valoración de muestras que contienen los ingredientes del producto trofín incluyendo la sangre, la cual es el componente que mayoritariamente aporta el nitrógeno amínico y compararla con el producto.
2. Determinar la linealidad en el rango de concentraciones de nitrógeno amínico, hasta obtener este parámetro un valor por debajo de 0,07 (límite inferior de la especificación de calidad) y 5 valores por encima de este.
3. Determinar la precisión (repetibilidad y precisión intermedia) del ensayo para muestras que contendrán valores iguales o mayores de 0,07 de nitrógeno amínico.
4. Determinar la exactitud de la cuantificación del nitrógeno amínico, primero utilizando un patrón que verifique que la técnica cuantifica correctamente (por triplicado) y con esto hacer la determinación de nitrógeno amínico a la muestra para determinar la concentración exacta que tiene esta y preparar 3 concentraciones diferentes de 0,06; 0,07 y 0,08 de Na (concentración de nitrógeno amínico en la muestra) las cuales serán valoradas por triplicado.
5. Determinar el rango del ensayo, a partir de la determinación de la precisión, linealidad y exactitud, con la utilización de diferentes concentraciones de nitrógeno amínico.

  ]]> RESULTADOS

En la tabla se presentan los resultados obtenidos en la validación del nitrógeno amínico efectuada para el producto trofin donde se cumple con los rangos de aceptación para los parámetros estudiados (linealidad, precisión, exactitud y especificidad), en las concentraciones seleccionadas y las condiciones de trabajo establecidas.

DISCUSIÓN

En el estudio realizado de especificidad (tabla) pudo comprobarse que la sumatoria de los Na de la mezcla (0,103) fue similar al Na del producto final (0,106). Se demostró estadísticamente que no existen diferencias significativas para una p > 0,05 entre la sumatoria del nitrógeno amínico de la mezcla de las materias primas y del trofin como producto final, para una t de Student de 0,3633

En cuanto a la linealidad del patrón se calculó el Na de 3 réplicas del patrón y su promedio resultó 0,0918; el coeficiente de correlación fue r²= 0,9930 para un criterio de aceptación de r² ³ 0,98; además se realizó la prueba de la t de Student y el criterio de aceptación para p > 0,05 se cumplió. Se efectuó la determinación del Na a 3 réplicas de muestra y se halló el promedio a la muestra (0,096) y se le calculó el promedio del coeficiente de correlación (r²= 0,9992) para el criterio de aceptación de r² ³ 0,98; además se observó la prueba de la t de Student para la muestra y el criterio de aceptación para p > 0,05 se cumplió.

Se realizó además el análisis de regresión donde se pudo observar tanto para la muestra como al patrón los coeficientes de correlación para cada una de las 3 réplicas realizadas, donde r² ³ 0,98.

Los resultados de repetibilidad se realizaron a 3 réplicas de concentraciones diferentes. En la precisión intermedia se efectuó la misma determinación que en el ensayo de precisión pero en este caso, con la utilización de 2 analistas, para igual número de réplicas; se observó que el coeficiente de variación cumplió con el criterio de aceptación para el mismo que debe ser menor del 10 %. Se comprobó la exactitud para el Na calculado para cada una de las concentraciones analizadas y la cercanía de los valores promedios obtenidos con respecto a los esperados.

En la precisión intermedia se realizó el procesamiento estadístico para las tres concentraciones analizadas, así como el por ciento de recuperación y la prueba de la t de Studen, la cual cumple con los criterios de aceptación para p > 0,05.

Por último, el análisis del rango de ensayo cumple con los criterios de aceptación establecidos para precisión, exactitud y linealidad para las concentraciones de Na ³ 0,07 que es el rango de ensayo establecido en la Especificación de Calidad para el trofin. ]]> De acuerdo con los resultados obtenidos en la validación realizada se considera que la técnica del nitrógeno amínico quedó validada.

Estos resultados se consideran válidos siempre y cuando la técnica se realice como está establecida y se necesitará una revalidación si se produce un cambio en dicho procedimiento o si varían las condiciones establecidas de laboratorio. Solo se comprobarán los parámetros que sean necesarios.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Aznar E. Informe Registro Trofin. La Habana: Oficina CECMED; 1998.

2. Aznar E. González R. Informe final del Proyecto obtención de medicamentos antianémicos y reconstituyentes de origen natural. La Habana: Biocen; 2001. p. 77-8.

3. ICH Topic Q2A. Validation of Analytical Methods: Definitions and Terminology, 1995.

4. United States Pharmacopeia 24 and National Formulary 19.Validation of compendial methods. United States Pharmacopeial Convention. Rockville: Mack Printing; 2000. p. 2149

5. Castro M, Gascón S, Pujol M, Sans JM, Vicente L. Validación de Métodos Analíticos. Asociación Española de Farmacéuticos de la Industria. Monografía AEFI. Sección Catalana. Comisión de Normas de Buena Fabricación y Control de la Calidad. Edición Hewlett Packard; 1989.

6. Calpena AC, Escribano E, Fernández C. Validación de los métodos analíticos .Farm Clin. 1991;7(9):749-58.

7. Rampazoo P. Standardisation and Validation of Analytical Methods in the Pharmaceutical Industry. II Farmaco. 1990;45:807-15.

Recibido: 9 de noviembre de 2007.
Aprobado: 10 de diciembre de 2007.

]]> 1 1998 2 2001 77-8 3 1995 4 United States Pharmacopeia 24 and National Formulary 2000 2149 5 1989 6 1991 7 9 9 749-58 7 1990 45 807-15