Metodología de pesquisa preclínica de actividad anti-herpesvirus a partir de productos naturales
Methodology for the preclinical screening of anti-herpesvirus activity starting from natural products
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Gloria del Barrio AlonsoI; Ángel L. Álvarez RodríguezII; Suria M. Valdés GarcíaIII; Francisco Parra FernándezIV
I Doctora en Ciencias Biológicas. Profesora Titular. Departamento de Microbiología y Virología. Facultad de Biología. Universidad de La Habana. La Habana, Cuba.
II Licenciado en Microbiología. Departamento de Microbiología y Virología. Facultad de Biología. Universidad de La Habana. La Habana, Cuba.
III Doctora en Ciencias Biológicas. Asistente. Departamento de Microbiología y Virología. Facultad de Biología. Universidad de La Habana. La Habana, Cuba.
IV Doctor en Ciencias Biológicas. Catedrático de Bioquímica. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular. Universidad de Oviedo. Oviedo, España.
RESUMEN ]]>
Herpesviridae es una de las familias virales de mayor impacto en la salud humana y animal. Los virus del herpes simple constituyen causa de infecciones muy comunes, con un amplio espectro de manifestaciones clínicas. La naturaleza latente de la infección que le permite al virus escapar de los efectores de la respuesta inmunológica, ha imposibilitado la obtención de vacunas antiherpéticas eficaces. Esto ha motivado la búsqueda de productos antiherpéticos, lo cual trae consigo la necesidad de establecer un sistema de evaluación preclínica de productos naturales y sintéticos mediante una metodología de pesquisa rápida in vitro. En el presente trabajo se muestra la metodología y fundamentación del sistema de ensayos empleado por el Grupo de Antivirales Naturales de la Facultad de Biología (Universidad de La Habana) para el pesquisaje de productos con propiedades antiherpéticas. Dicha metodología incluye la evaluación primaria y varios ensayos secundarios, encaminados a la determinación de los mecanismos de acción.
Palabras clave: Antiviral, antiherpético, virucida, productos naturales.
ABSTRACT
Herpesviridae is one of the viral families of greatest impact on human and animal health. HSVs are the etiological agents of very common infections associated with a broad range of clinical symptoms. The latent nature of the infection allows the virus to escape from immune responses, hindering the obtention of efficient anti-herpes vaccines. This fact has encouraged scientists to search new anti-herpes drugs, and that's why the establishment of a rapid methodology for the in vitro evaluation of new products with potential antiviral activity is urgently needed. In this work, we describe the complete guide followed by the Antiviral Natural Products Research Group (Faculty of Biology, University of Havana) to perform the screening for antiviral activities among natural products. This guide includes the preliminary evaluation assay and a variety of secondary tests.
Key words: Antiviral, anti-herpes, virucide, natural products.
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INTRODUCCIÓN
La familia Herpesviridae agrupa entidades de gran importancia clínica y veterinaria. Los herpesvirus que infectan humanos poseen elevadas tasas de prevalencia, que oscilan entre 45 y 90 %. Los virus del herpes simple tipo 1 (HSV-1) y tipo 2 (HSV-2) se destacan por la variedad de sintomatologías que provocan, las cuales incluyen lesiones cutáneas, queratoconjuntivitis, gingivoestomatitis, encefalitis, entre otras.1 La infección genital, generalmente por HSV-2, constituye un factor de riesgo para la transmisión del HIV.2
Los herpesvirus establecen infecciones latentes, con episodios de recurrencia y reaparición de los síntomas.3 En el estado de latencia la expresión genética viral es escasa o nula, lo que permite a los virus escapar de los efectores inmunológicos. Esto ha hecho muy difícil la obtención de vacunas eficaces contra herpes4 y ha motivado la búsqueda de fármacos que reduzcan su multiplicación, la intensidad y duración de los síntomas, y propicien su retorno al estado de latencia. Se han obtenido compuestos sintéticos antiherpéticos, sin embargo, su elevada toxicidad y el desarrollo de resistencia han limitado su eficacia.5 Por todo lo anterior la búsqueda de nuevos antivirales resulta una necesidad y los productos naturales, entre ellos las plantas, representan una fuente prometedora con gran variedad de constituyentes químicos con diferentes diana y mecanismos de acción.6
Para evaluar antivirales es preciso contar con una metodología organizada. En la literatura científica existen numerosos métodos in vitro e in vivo para evaluar la actividad antiherpética de extractos de plantas o moléculas derivadas de estos, sin embargo, son muy diferentes entre sí, y no se dispone de una metodología centralizada. El objetivo del presente trabajo es presentar la metodología desarrollada por el Grupo de Antivirales Naturales de la Facultad de Biología (Universidad de La Habana) para evaluar productos naturales frente a herpesvirus utilizando como modelo cultivos celulares dependientes de anclaje.
MÉTODOS
Se utilizaron como fuentes primarias de información, artículos publicados por el Grupo de Antivirales Naturales de la Facultad de Biología en revistas científicas nacionales e internacionales, registradas en las bases de datos SciELO o PubMed, así como revisiones y artículos de investigación relacionados con la temática, publicados por otros grupos. Todos los extractos vegetales utilizados en los trabajos tomados como ejemplo se prepararon mediante extracción acuosa o con solventes orgánicos a partir de hojas y tallos de la especie Phyllanthus orbicularis HBK, endémica de Cuba, colectada en la provincia Pinar del Río, en agosto de 1997. Un ejemplar de esta planta fue depositado en el Jardín Botánico Nacional para su autenticación, ingresado con número de herbario 7-220-HAJB. ]]>
SELECCIÓN DEL SISTEMA VIRUS-CÉLULA ADECUADO
El establecimiento de las condiciones en que se realizarán los ensayos es el punto de partida para la evaluación de un producto como antiviral. La sensibilidad de los cultivos celulares a los virus y la respuesta de estos a un antiviral pueden variar considerablemente entre sistemas, de ahí la necesidad de incluir en las evaluaciones diferentes tipos celulares y variantes de virus. La inclusión en los ensayos de cepas virales estándares conjuntamente con aislamientos clínicos, así como variantes virales con diferente susceptibilidad a los fármacos de referencia, posibilita la validación de la investigación. Con este fin deben incluirse además ensayos en los que se empleen cultivos celulares normales o diploides procedentes de la especie hospedero en la que se pretende aplicar con posterioridad el producto evaluado.7
EVALUACIÓN DE LA CITOTOXICIDAD DEL PRODUCTO
La primera etapa en el estudio de cualquier producto como antiviral potencial consiste en un ensayo cuantitativo que permite evaluar sus efectos nocivos sobre las células o citotoxicidad, expresada como el valor de concentración que provoca daño celular evidente al 50 % de los cultivos tratados (concentración citotóxica media, CC50). El conocimiento de este valor posibilita posteriormente emplear intervalos de concentración inferiores o subtóxicos en los ensayos de actividad antiviral. Se han descrito numerosos procedimientos para estimar el valor de CC50; los métodos colorimétricos son más empleados. Entre estos se destaca el ensayo del MTT basado en la reducción del compuesto bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2-difeniltetrazolio (MTT) por enzimas mitocondriales que se encuentran activas en las células viables,8 con formación de un precipitado púrpura de formazán y el consecuente aumento de absorbancia. Este método ha sido ampliamente utilizado para ensayos de citotoxicidad.9,10
ENSAYO PRIMARIO PARA EL PESQUISAJE DE ACTIVIDAD ANTIVIRAL
La determinación de la actividad antiviral de un producto o compuesto consiste en la evaluación de su capacidad de reducir o anular la multiplicación viral en los sistemas empleados.11 Por tanto, dicha determinación no es más que medir la replicación viral en presencia y ausencia del producto y compararlas entre sí. En estos ensayos la preincubación de los cultivos celulares con el producto a evaluar antes de la inoculación con el virus, garantiza que ningún mecanismo posible de acción antiviral quede excluido durante la pesquisa, lo que incluye la acción directa inactivante sobre la partícula viral extracelular. ]]>
Evaluación basada en ECP
La mayoría de los virus son capaces de provocar cambios bruscos en las células durante su replicación, conocidos en su conjunto como efecto citopático (ECP). En muchas ocasiones estos cambios pueden apreciarse muy fácilmente al microscopio óptico invertido como una profunda alteración de la morfología celular. Un buen método para la evaluación de un antiviral consiste por tanto en la determinación de la capacidad del producto de reducir o anular el ECP inducido por el virus. Aquella concentración que provoca reducción del ECP al 50 % se conoce como concentración efectiva media (CE50) y es la manera de expresar cuantitativamente la actividad antiviral.12
Evaluación por el método de placas
Además del ECP característico sobre las monocapas celulares, algunos virus son capaces de formar placas de lisis cuando se multiplican en determinados sistemas de cultivo, recubiertos por un medio semisólido como la agarosa o la carboximetilcelulosa. En este modelo la difusión de las partículas virales formadas de novo es muy limitada debido a la consistencia semisólida, por lo que la infección está restringida a aquellas células vecinas a la que abandonó la partícula infectante. Esto conlleva a la formación de una zona de lisis celular masiva (placa de lisis) visible a simple vista. Teniendo en cuenta las diluciones apropiadas, cada placa se considera iniciada por una simple partícula viral. La actividad antiviral de un producto puede ser entonces medida como su capacidad para reducir el número de placas de lisis formadas, con respecto al control.13
]]> Evaluación basada en la viabilidad celular
El método colorimétrico del MTT anteriormente mencionado u otro similar también puede ser empleado en la evaluación de la actividad antiviral.13,14 En este caso, este ensayo se fundamenta en que la replicación viral, conjuntamente con los cambios morfológicos que provoca, trae aparejada una marcada disminución de la viabilidad celular y alteración de las funciones mitocondriales. Un producto antiviral debe ser capaz de incrementar la viabilidad celular y mejorar la función mitocondrial al inhibir la replicación viral en un intervalo de concentraciones subtóxicas. Esta inhibición viral se puede cuantificar mediante el ensayo del MTT a través de la siguiente fórmula: % de inhibición= (AV+E - ACV) / (ACC - ACV) × 100; donde AV+E es la media de las absorbancias de los cultivos inoculados y tratados con la concentración en cuestión; ACC es la media de las absorbancias de los controles celulares y ACV es la media de las absorbancias de los controles de virus.15 La concentración del producto asociada con un 50 % de inhibición define la CE50 en este ensayo. Se puede lograr una buena correspondencia entre ambos métodos mediante la optimización y el ajuste de algunas variables del ensayo como la dosis viral, el tiempo de lectura o punto final, el intervalo de concentraciones de tratamiento, número de réplicas, entre otras.
DETERMINACIÓN DEL ÍNDICE SELECTIVO
El valor de CE50 de un producto con actividad antiviral resulta de poco valor si previamente no se estudió su citotoxicidad.7 El índice selectivo (IS) se define como el cociente entre la CC50 y la CE50 y representa una medida de la distancia entre la concentración antiviral y aquella que provoca efectos nocivos sobre las células, de ahí que mientras mayor es su valor mejor es el antiviral desde el punto de vista de su seguridad e inocuidad. No existe un valor de corte para esta magnitud a partir del cual se defina un buen antiviral; sin embargo, algunos autores consideran que para un producto natural, un IS mayor que 2 es suficiente.11 La tabla 1 muestra los valores de CC50, CE50 e IS correspondientes a un extracto acuoso de la planta Phyllanthus orbicularis frente a varios herpesvirus en diferentes tipos celulares.10 El valor de IS es muy útil además para monitorear la purificación de principios activos presentes en los productos naturales y debe aumentar a medida que se avanza en el proceso con respecto a los extractos crudos. En la tabla 2 se presentan estos valores para las fracciones butanólica y acética obtenidas de esta misma especie vegetal en una etapa preliminar de la purificación, frente a 2 cepas de HSV-1 con diferente sensibilidad al aciclovir (ACV), fármaco de referencia.10
ESTUDIO DE LOS MECANISMOS DE ACCIÓN: ENSAYOS SECUNDARIOS
Comoquiera que el ensayo de pesquisa primaria no permite conocer en detalle la actividad antiviral, se han diseñado un conjunto de experimentos denominados ensayos secundarios, encaminados a caracterizar dicha actividad y conocer en qué momento del ciclo replicativo el producto tiene su acción, así como las posibles dianas moleculares de la inhibición. El éxito de estos ensayos depende en gran medida de un buen conocimiento del virus en cuestión y su replicación. ]]>
Estudio del momento de acción: ensayo de tiempo de adición
El ensayo de tiempo de adición se realiza añadiendo el producto a diferentes tiempos antes, durante y después de la infección en cultivos celulares independientes (un cultivo para cada tiempo a estudiar) y al cabo de un intervalo suficiente para que se complete la replicación en los controles virales sin tratar se determina el título infectivo y se analiza cómo se comporta su magnitud respecto a cada tiempo de adición. El momento de la infección así como la cantidad de virus, células y producto añadido no varía, lo que cambia es el momento en que se añade con respecto al inicio de la infección. El producto deja de ejercer su acción cuando se añade en un momento en el que, al avanzar la infección, se ha sobrepasado el evento del ciclo replicativo susceptible de ser bloqueado. Por tanto, este ensayo permite correlacionar aproximadamente el momento en que aumenta el título (cese de la inhibición) con la diana de la inhibición, si se conoce la cinética de multiplicación del virus. En la figura se observa la variación del título infectivo de HSV-1 ante el tratamiento a diferentes tiempos después de la infección, con las fracciones acético-acuosa y butanólica de P. orbicularis. El cese de la inhibición que tiene lugar cuando estos productos se añaden al cabo de 1 h posinfección evidencia que su diana es un evento temprano de la replicación de este herpesvirus.10
Variación de la multiplicidad de infección
Un buen punto de partida en la caracterización de la actividad antiviral de un producto es conocer si este ejerce su acción dentro de la célula o sobre la partícula extracelular. Un primer acercamiento lo brinda el ensayo de variación de la multiplicidad de infección (MDI).9 Se denomina multiplicidad de infección (MDI) a la razón entre la cantidad de virus en el inóculo y la cantidad de células en el cultivo. Así por ejemplo, una MDI equivalente a uno, significa que cada célula en la monocapa puede ser infectada teóricamente por una partícula viral. La comparación de la actividad antiviral frente a MDI diferentes puede brindar información sobre la naturaleza de la inhibición. Si la actividad del producto se mantiene al aumentar la MDI es muy probable que el producto, internalizado por las células, ejerza su acción sobre algún evento replicativo intracelular. Si por el contrario al aumentar la MDI se observa una disminución de la sensibilidad del virus al producto es probable que tenga acción directa sobre la partícula y esta disminuya por agotamiento del producto en un exceso de viriones,7 como ocurrió en el modelo BHV-1-células MDBK tratado con un extracto acuoso de P. orbicularis (tabla 3).
]]> Acción virucida
La acción inactivante directa de un producto sobre los viriones puede ser evaluada mediante el tratamiento en determinadas condiciones de suspensiones virales de título conocido. El efecto virucida conlleva una disminución brusca en el título infectivo residual de la suspensión con respecto a los controles no tratados. Este es el fundamento del ensayo virucida extracelular.9,10,16 Numerosos compuestos de naturaleza química variada presentes en los extractos vegetales manifiestan esta acción.17 Se pudo comprobar que las fracciones butanólica y acética de P. orbicularis presentan esta actividad. Los valores de CE50 e IS para la acción virucida de estos extractos frente a HSV-1 se muestran en la tabla 4. Los altos valores de IS virucidas obtenidos (371-1040) demuestran que la componente principal de la actividad antiviral de P.orbicularis contra HSV-1 consiste en su acción inactivante sobre la partícula viral y es independiente de la sensibilidad de la cepa al aciclovir y del sistema hospedero utilizado.10
Inhibición de la adsorción/penetración/desnudamiento: ensayo de tiempo de eliminación
La desnaturalización, inactivación o bloqueo de los receptores presentes en las membranas celulares utilizados por los virus para penetrar al citoplasma, conlleva a un fracaso en la infección. Algunos compuestos antivirales ejercen su acción de esta manera. Una forma sencilla de evaluarlo consiste en la adición del producto a los cultivos celulares y su eliminación antes de la infección.16 Si el compuesto es capaz de unirse fuertemente a los receptores bloqueando la adsorción, la infección no debe tener lugar aun después de ser eliminado el producto del medio. Numerosas variaciones a este ensayo son posibles con vistas a estudiar el efecto más allá de la unión a los receptores: sobre la penetración y el desnudamiento viral. Un ejemplo de ello es el ensayo de tiempo de eliminación. En este ensayo se preincuban los cultivos con el producto y se infectan, y a continuación el producto es retirado a diferentes tiempos después de la infección. Al final de un periodo de incubación suficiente para el desarrollo de ECP completo en los controles virales, se determina la productividad vírica de los cultivos tratados y se analiza cómo se comportan los títulos con respecto al tiempo de eliminación.
Inhibición de la síntesis de macromoléculas virales
Los ensayos destinados a evaluar la acción del producto sobre la biosíntesis de macromoléculas virales demandan un conocimiento más profundo de los virus empleados pues pueden requerir la utilización de cebadores o sondas de secuencias conocidas para detectar regiones específicas del genoma viral; o anticuerpos que reconozcan determinada proteína viral. No es objetivo del presente trabajo profundizar en el diseño de estos experimentos, aunque se mencionan algunos para conocimiento general: ]]>
- Cuantificación de la síntesis de ADN o ARN viral: El efecto de compuestos en la producción de ácido nucleico viral puede evaluarse mediante varias técnicas, que incluyen hibridación, reacción en cadena de la polimerasa (RCP), RCP en tiempo real, northern blotting, southern blotting, entre otros.
- Análisis de proteínas virales: El efecto de compuestos en la producción de proteínas virales inmediatas tempranas, tempranas y tardías, pueden evaluarse mediante western blotting, marcaje radiactivo y citometría de flujo, entre otras.
CONCLUSIONES
Numerosos métodos para estudiar las actividades antiherpéticas in vitro e in vivo de extractos de plantas o moléculas derivados de estos se describen actualmente en la literatura científica.18 La propuesta de nuestro programa de evaluación de productos o compuestos antiherpéticos se basa en el desarrollo de una pesquisa primaria capaz de definir la eficacia y citotoxicidad en los modelos celulares de distintos orígenes y clasificación; esto es, humanos y no humanos, así como líneas continuas y diploides. Ello permite determinar la concentración inhibitoria media y la concentración citotóxica media, criterios necesarios para la certeza de propiedad antiviral específica y no provocada por la acción tóxica de los productos en estudio. Por tal motivo se calcula el IS definido como la relación entre la concentración de la droga que causa el 50 % de toxicidad y la que inhibe la replicación viral en el 50 %.
Si bien al trabajar con extractos crudos este índice no posee tanto valor y significado como con compuestos puros o sintéticos, ya que en los extractos crudos el efecto tóxico y el antiviral no son necesariamente causados por los mismos componentes de la mezcla, siempre es un criterio que guía acerca de la verdadera actividad observada y permite especular acerca de esta. Por lo general el ensayo de citotoxicidad que más se emplea en este tipo de evaluaciones es el basado en el cambio de color del compuesto XTT o del MTT, incluido en nuestra metodología, aunque otros parámetros como la destrucción de la morfología celular o medición de la síntesis de DNA celular han sido utilizados.19
La metodología aquí descrita ha permitido poner en marcha un programa de búsqueda de fármacos antiherpéticos teniendo en cuenta los criterios de la evaluación de la eficacia, toxicidad, intervalo y mecanismo de acción de los diferentes compuestos o productos en estudio.
Este sistema de ensayos ha posibilitado identificar y demostrar la actividad y potencialidad de plantas utilizadas en la medicina popular y dar prioridad al estudio de aquellas que muestran resultados más interesantes. ]]>
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Recibido: 9 de enero de 2008.
Aprobado: 11 de febrero de 2008.
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Dra. C. Gloria del Barrio Alonso. Facultad de Biología. Universidad de La Habana. Calle 25 No. 455 entre I y J, municipio Plaza de la Revolución, La Habana, CP 10 400. Cuba. Correo electrónico: gbarrio@infomed.sld.cu
