PRODUCTOS NATURALES
Tamizaje de la actividad antifúngica de extractos de especies de la flora de Entre Ríos
Screening of antifungal activity of extracts present in Entre Ríos flora species
Eduardo P. Vivot LupiI; Cecilia I. Sánchez BrizuelaII; Francisco Cacik Jeifetz III; Christian J. Sequin AcostaIV
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IIngeniero Químico. Profesor Titular. Departamento Ciencias Básicas. Facultad de Ciencias Agropecuarias-UNER. Entre Ríos, Argentina.
IIIngeniero Agrónomo. Máster en Ciencias. Departamento Ciencias Básicas. Departamento Ciencias Básicas. Facultad de Ciencias Agropecuarias-UNER. Entre Ríos, Argentina.
IIIIngeniero Químico. Profesor Adjunto. Departamento Ciencias Básicas. Facultad de Ciencias Agropecuarias-UNER. Entre Ríos, Argentina.
IVPerito Mercantil. Auxiliar de Docencia. Departamento Ciencias Básicas. Facultad de Ciencias Agropecuarias-UNER. Entre Ríos, Argentina.
RESUMEN
Las plantas medicinales constituyen un recurso invalorable por su potencialidad farmacológica que hace necesario estudiarlas ante la demanda de nuevos fármacos, especialmente con actividad antifúngica. La flora de Entre Ríos (Argentina) posee numerosas especies con antecedentes etnobotánicos de uso como antisépticos en heridas. Los extractos de 6 especies vegetales seleccionadas fueron evaluadas en su actividad antifúngica mediante el método de microdilución en caldo, contra cepas tipificadas de Aspergillus niger y Trichophyton rubrum. Con excepción de Castela tweedii, las demás especies ensayadas, Baccharis articulata, Blepharocalyx salicifolius, Eichhornia azurea, Ludwigia peploides y Schinus fasciculatus, mostraron actividad in vitro en alguno de sus extractos, lo que auspicia la continuidad de los estudios. ]]>
Palabras clave: Plantas medicinales, actividad antifúngica; Castela tweedii, Baccharis articulata, Blepharocalyx salicifolius, Eichhornia azurea, Ludwigia peploides, Schinus fasciculatus.ABSTRACT
Medicinal plants are a valuable resource due to its pharmacological potentiality ant its study is necessary in the face of the demand of new drugs specially those having antifungal activity. The Entre Ríos (Argentina) has many species with ethnobotanical backgrounds used as antiseptic agent for wounds. Extracts from 6 selected vegetal species were assessed for its antifungal activity by broth microdilution to typified strains of Aspergillus nigery Trichophyton rubrum. Except for Castela tweedii, the other assayed species, Baccharis articulate, Blepharocalyx salicifolius, Eichhornia azurea, Ludwigia peploides and Schinus fasciculatus showed in vitro activity in some extracts, being necessary a continuing study.
Key words: Medicinal plants, antifungal activity, Castela tweedii, Baccharis articulata, Blepharocalyx salicifolius, Eichhornia azurea, Ludwigia peploides, Schinus fasciculatus.
INTRODUCCIÓN
Las plantas medicinales han sido el recurso tradicional más importante del hombre para curar sus dolencias, en particular las infecciones microbianas, y constituyen una importante fuente en la búsqueda de nuevos fármacos con dichas actividades farmacológicas, en especial por la creciente resistencia de los microorganismos a los fármacos actuales, a la aparición de nuevas especies patógenas, en especial de origen viral o fúngico, estas últimas principalmente en pacientes inmuno comprometidos.
El 74 % de los fármacos de uso clínico de origen vegetal han sido descubiertos a través de información etnomédica,1 ya que el uso de las plantas con fines curativos constituye un indicio de las potencialidades farmacológicas de estas. La provincia de Entre Ríos (Argentina) posee una vasta flora con antecedentes etnobotánicos de uso medicinal, con alrededor de 500 especies reconocidas en el uso popular, muchas de las cuales son de utilidad para el tratamiento de dermatitis, infecciones, eczemas, furúnculos2,3 y otras afecciones atribuidas a bacterias y hongos.
La pérdida de biodiversidad en esta región debido al avance de la agricultura demanda una pronta realización de los estudios de la flora. Esta urgencia se ve acrecentada debido a que el conocimiento acerca de los usos medicinales de la flora nativa se ha ido desvaneciendo por falta de transmisión de las culturas nativas, por predominancia del uso de las especies exóticas. ]]>
Baccharis articulata (Lam.) Pers (Asteraceaae), cuyo nombre vulgar es "carqueja" o "carquejilla", es un arbusto de uso medicinal de un metro de altura, muy ramoso, de flores cremosas en capítulos solitarios o en falsas espigas, sus tallos y la planta en polvo seca se utilizan para curar enfermedades de la piel, lepra, herida, úlceras y llagas sifilíticas.4 Esta especie ha mostrado poseer actividad antioxidante y prooxidante,5 actividad antiviral6 y efecto antiinflamatorio.7 Otras especies del mismo género mostraron actividad antifúngica.8 También se detectó actividad antibacteriana en B. nitida.9 En los estudios fitoquímicos del genero se han aislado flavonoides y diterpenos,10 también aceites esenciales11 y alcaloides.12Castela tweedii Planch-Simaroubaceae- , de nombre común "granadilla", es un arbusto espinoso de la familia Simarubaceae de 1 a 2 m de altura, hojas cartáceas, elípticas, flores anaranjadas y su fruto es una drupa roja. Sus hojas, corteza, raíz y tallo son utilizadas popularmente contra la disentería y las diarreas, y también como tónico del sistema gástrico.13 En Castela texana, especie de igual género, se ha detectado efecto hipoglucemiante.
Schinus fasciculatus (Griseb.) I. M. Johnston var. fasciculatus (Anacardiaceae), comúnmente llamado "molle", "molle de curtir" y "moradillo" es un árbol polígamo dioico, de 6 a 8 m de altura, con hojas dimorfas; flores amarillentas en pseudorracimos; y sus frutos son drupas globosas de 4 a 5 mm de diámetro. Se encuentra en Bolivia, Paraguay y Argentina, es más abundante en la provincia de Chaco (Argentina).14 Prefiere suelos alcalinos y es muy polimorfito.15 Florece en invierno y crece en orillas de arroyos y en el monte xerófilo.16 Las hojas de esta planta se utilizan en decocción para lavar heridas, su resina es usada externamente para el dolor de cabeza, envaradura del cuello15 en baños contra el resfrío17 y como antiinflamatoria en emplastos en casos de fracturas y hernias. 4 En especies del mismo género se ha encontrado propiedad insecticida frente a ninfas y huevos de Triatoma infestans,18 así como también actividad analgésica, antiinflamatoria19 y antimicrobiana. En cuanto a estudios fitoquímicos, en el género Schinus sp se han aislado diferentes compuestos, como es el caso de Schinus terebenthefolius de donde se han aislado triterpenos20 y un inhibidor de la secreción de fosfolipasa A2.21
Ludwigia peploides (Kunth) P. H. Raven subsp. peploides (Onagraceae) Jussiaeae repens L., también conocida como "duraznillo de agua", es una hierba perenne, con tallos tendidos o flotantes, radicantes, y ramas ascendentes hasta de 0,60 m de altura; hojas obtusas, atenuadas en la base en largo pecíolo; flores amarillas, axilares; fruto cápsula cilíndrica, pilosa. Sus hojas machacadas se usan para curar forúnculos;22 con aceite de ricino se aplica contra escaras y tiña de cabeza, y en infusión o cataplasmas para lavar y curar heridas.4 El estudio de los componentes ha encontrado n-alcanos en Ludwigia adscendens;23 triterpenos24 y otros compuestos25 y sustancias cianogenéticas26 en L. octovalvis. Entre las bioactividades detectadas se citan la actividad antibacteriana de L. adscendens,27 actividad anticancerigena24 en L. octovalvis y actividad antidiarreica en L. hyssopifolia Linn.28
Blepharocalyx salicifolius (Kunth) O. Berg (Myrtaceae), cuyo nombre vulgar es "anacahuita" o "mirta", es un árbol de 5 a12 m de altura con hojas lanceoladas, fragantes; flores blancas en dicasios, muy perfumadas; fruto baya globosa rojo-anaranjada. La maduración de los frutos es gradual. Se encuentra distribuida en toda Argentina en montes serranos y también fluviales, dispersa en el sur de Brasil, Paraguay y Uruguay. Sus hojas se usan como estomacales, digestivas y antileucorreicas (en cocimiento); mezcladas con las de Myrcianthes pungens (O.Berg.) contra flujos o leucorrea.29 Hojas y corteza de acción antitusiva, expectorante, pectoral, astringente y antidiarreica (con miel o azúcar).30 Polvo de hojas usado como vulnerario30 y para caída del ombligo.29 Se ha encontrado actividad antifúngica en B. tweediei.31 Se han aislado compuestos y evaluado actividad citotóxica,32 y se encontró actividad antibacteriana en extractos acuosos,33 diclorometánicos34 y aceite esencial de hojas.35
Eichhornia azurea (Sw.) Kunth (Pontederiaceae), vulgarmente denominadas "aguapei" o "camalote" es una hierba perenne, de 0,50 a 0,80 m de altura, flotante, con tallos largos; hojas aéreas largamente pecioladas, con pecíolos cilíndricos y láminas redondeadas; flores numerosas, violáceas, en espigas; fruto cápsula apiculada. Las partes usadas son las flores, hojas secas o frescas y raíces en infusiones cordiales. Raíces y hojas secas en vino se utilizan contra la disentería y la gonorrea. Las hojas frescas trituradas en la frente calman el dolor de cabeza y otros dolores del cuerpo.4,17,29
El objetivo del presente trabajo fue evaluar la actividad antifúngica de los extractos de 5 especies de la flora de Entre Ríos (Argentina) para validar su uso en medicina popular.
MÉTODOS
]]> Material vegetal
Las especies seleccionadas para el estudio fueron identificadas, prensadas, secadas, determinadas, preservadas, etiquetadas, numeradas e incorporadas al Herbario de la Facultad de Ciencias Agropecuarias-UNER (ERA). Los ejemplares de referencia son: Baccharis articulata (Lam.) (Muñoz 4805); Blepharocalyx salicifolius (Kunth) (Muñoz 603); Castela tweedii Planch (Muñoz 3857); Eichhornia azurea (Sw.) Kunth (Muñoz 4821), Ludwigia peploides (Kunth) (Muñoz 4769); Schinus fasciculatus (Griseb.) (Muñoz 2153).
El material fresco de Schinus fasciculatus fue molido en molino a cuchillas previo a la extracción. Los demás vegetales fueron secados a la sombra y las muestras fueron molidas en molino de discos.
Se investigaron las partes del vegetal usadas popularmente como antimicrobianos, como se menciona en la introducción.
Material biológico
Los microorganismos empleados en el ensayo fueron las cepas fúngicas tipificadas de Aspergillus niger ATCC 16404 y Trichophython rubrum ATCC 28188.
Extractos vegetales
Los extractos etanólicos y metanólicos se prepararon agregando 200 mL de solvente a temperatura ambiente a 100 g de vegetal fresco y picado de Schinus fasciculatus, en tanto que para Baccharis articulata, Blepharocalyx salicifolius, Castela tweedii, Eichhornia azurea y Ludwigia peploides se emplearon 50 g de material seco y molido de cada especie. Cada extracto se dejó en maceración durante 24 h y luego se filtró, repitiéndose 3 veces el procedimiento. Los extractos de cada especie fueron reunidos, el solvente fue eliminado al vacío hasta obtener un residuo sólido. Los extractos fueron conservados a 2 ºC hasta su uso en el ensayo.
La infusión acuosa se preparó según la Farmacopea Argentina.36 A 10 g de cada especie, se le agregaron 200 mL de agua a temperatura de ebullición y se dejó en contacto durante 20 min. El extracto fue filtrado y liofilizado.
Ensayo de la actividad antifúngica ]]>
Los extractos fueron confrontados con las cepas fúngicas tipificadas aplicándose el método de microdilución en caldo37 para ensayo de hongos filamentosos, y se evaluó la actividad mediante la concentración inhibitoria mínima (CIM) encontrada.Se prepararon diluciones dobles seriadas 1:2 de extracto entre 2 000 a 31,25 µg/mL en medio de cultivo RPMI-1640 (GIBCO), según la técnica citada.37
El inóculo consistió en una suspensión de conidios con una concentración de 104 conidios/mL que se conservó en frío hasta su uso.
Se utilizaron placas de 96 pozos, estériles y con fondo plano en las que se distribuyeron 100 µL de la dilución del extracto y 100 µL de la suspensión del inóculo de las cepas fúngicas tipificadas de Aspergillus niger y Trichophyton rubrum. El pocillo de control de crecimiento fúngico se completó con 100 mL de medio de cultivo y 100 µL de suspensión de inóculo.
Las placas fueron incubadas en atmósfera húmeda a 28 ºC durante 7 días. Los ensayos se realizaron por duplicado. Se considero ensayo positivo al observarse visualmente una reducción del 50 % del crecimiento fúngico con respecto al control, tal como lo indican Cantón Lacasa y otros (2001).37
RESULTADOS
Se muestran los resultados de la actividad antifúngica de los extractos ensayados contra A. niger (cuadro 1) y contra T. rubrum (cuadro 2), con las correspondientes CIM encontradas.
Cuadro 1. Actividad antifúngica de extractos etanólicos, metanólicos y acuosos contra A. niger
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| Especies vegetales | Extractos | Aspergillus niger ATCC 16404 Concentraciones en ?g/mL | ||||||
| 1000 | 500 | 250 | 125 | 62,2 | ]]> 31,1 | 15,6 | ||
| Schinus fasciculatus | ETOH | (+) | (+) | (+) | (+) | (+) | (-) | (-) |
| MEOH | (-) | ]]> (-) | (-) | (-) | (-) | (-) | (-) | |
| Aq. | (+) | (-) | (-) | (-) | ]]> (-) | (-) | (-) | |
| Baccharis articulata | ETOH | (-) | (-) | (-) | (-) | (-) | (-) | (-) |
| MEOH | ]]> (-) | (-) | (-) | (-) | (-) | (-) | (-) | |
| Aq. | (-) | (-) | (-) | ]]> (-) | (-) | (-) | (-) | |
| Castela tweedii | ETOH | (-) | (-) | (-) | (-) | (-) | (-) | ]]> (-) |
| MEOH | (-) | (-) | (-) | (-) | (-) | (-) | (-) | |
| Aq. | (-) | (-) | ]]> (-) | (-) | (-) | (-) | (-) | |
| Ludwigia peploides | ETOH | (-) | (-) | (-) | (-) | (-) | ]]> (-) | (-) |
| MEOH | (-) | (-) | (-) | (-) | (-) | (-) | (-) | |
| Aq. | (+) | ]]> (+) | (+) | (+) | (-) | (-) | (-) | |
| Blepharocalyx salicifolius | ETOH | (+) | (+) | (-) | ]]> (-) | (-) | (-) | (-) |
| MEOH | (-) | (-) | (-) | (-) | (-) | (-) | ]]> (-) | |
| Aq. | (+) | (+) | (+) | (+) | (+) | (+) | (+) | |
| Eichhornia azurea | ETOH | (+) | ]]> (+) | (+) | (-) | (-) | (-) | (-) |
| MEOH | (-) | (-) | (-) | (-) | ]]> (-) | (-) | (-) | |
| Aq. | (-) | (-) | (-) | (-) | (-) | (-) | (-) | |
Cuadro 2. Actividad antifúngica de extractos etanólicos, metanólicos y acuosos contra T. rubrum
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]]> Especies vegetales |
Extractos | Trichophython rubrum ATCC 28188 Concentraciones en ìg/mL | ||||||
|
1000 | 500 | 250 | 125 | ]]> 62,2 | 31,1 | 15,6 | ||
|
Schinus fasciculatus | ETOH | (+) | (-) | (-) | (-) | ]]> (-) | (-) | (-) |
| MEOH | (+) | (+) | (+) | (-) | (-) | (-) | (-) | |
| Aq. | ]]> (-) | (-) | (-) | (-) | (-) | (-) | (-) | |
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Baccharis articulata | ETOH | (+) | ]]> (+) | (-) | (-) | (-) | (-) | (-) |
| MEOH | (-) | (-) | (-) | (-) | ]]> (-) | (-) | (-) | |
| Aq. | (+) | (+) | (-) | (-) | (-) | (-) | (-) | |
| Castela tweedii | ETOH | ]]> (-) | (-) | (-) | (-) | (-) | (-) | (-) |
| MEOH | (-) | (-) | (-) | ]]> (-) | (-) | (-) | (-) | |
| Aq. | (-) | (-) | (-) | (-) | (-) | (-) | ]]> (-) | |
| Ludwigia peploides | ETOH | (-) | (-) | (-) | (-) | (-) | (-) | (-) |
| MEOH | (-) | (-) | ]]> (-) | (-) | (-) | (-) | (-) | |
| Aq. | (+) | (+) | (+) | (+) | (-) | ]]> (-) | (-) | |
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Blepharocalyx salicifolius | ETOH | (+) | (+) | (-) | (-) | (-) | (-) | ]]> (-) |
|
MEOH | (+) | (-) | (-) | (-) | (-) | (-) | (-) | |
| ]]> Aq. | (+) | (+) | (+) | (+) | (+) | (+) | (+) | |
|
]]> Eichhornia azurea | ETOH | (+) | (+) | (+) | (-) | (-) | (-) | (-) |
|
MEOH | ]]> (-) | (-) | (-) | (-) | (-) | (-) | (-) | |
| Aq. | (-) | (-) | ]]> (-) | (-) | (-) | (-) | (-) | |
MEOH: extracto en metanol; ETOH: extracto etanol; Aq.: extracto agua.
Ref: (+) se observa reducción del 50 % del crecimiento con respecto al control y (-) no se observa reducción de crecimiento.
En todos los casos los extractos secos se redisolvieron en el medio de cultivo.
La concentración de microorganismos tomada para el ensayo fue de 5x103 conidios/mL.
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Los resultados indican que los extractos etanólicos de las especies B. salicifolius y E. azurea poseen actividad contra A. niger con una CIM de 500 y 250 µg/mL, respectivamente, mientras que el extracto de S. fasciculatus exhibió la mayor actividad contra dicha cepa fúngica con una CIM de 62,2 µg/mL .
La actividad exhibida por los extractos acuosos contra A. niger se observó en las especies S. fasciculatus, L. peploides y B. salicifolius con CIM de 1 000, 125 y 15,6 µg/mL, respectivamente.
Se evidenció actividad contra T. rubrun en los extractos etanólicos de S. fasciculatus —con una CIM de 1 000 µg/mL— y de B. articulata —con una CIM de 500 µg/mL—; y de igual manera en los extractos de B. salicifolius y E. azurea con CIM de 500 y 250 µg/mL, respectivamente.
Hubo inhibición del crecimiento de T. rubrum por los extractos metanólicos de las especies S. fasciculatus y B. salicifolius, con CIM de 250 µbg/mL y 1 000 mg/mL, respectivamente; al igual que por los extractos acuosos de B. articulata, L. peploides y B. salicifolius, con CIM de 500, 125 y 15,6 µg/mL, respectivamente.
DISCUSIÓN
Estos resultados propician la continuidad de los estudios de las especies Baccharis articulata, Blepharocalyx salicifolius, Eichhornia azurea, Ludwigia peploides y Schinus fasciculatus, teniendo en cuenta sus potencialidades para la búsqueda de nuevos compuestos bioactivos, en particular en B. salicifolius, que mostró CIM mas baja de los ensayos contra ambos hongos. La misma especie tiene antecedentes en actividad antibacteriana en su extracto diclorometánico,34 y en particular contra una cepa clínica de Streptoccocus aureus Meticilino resistente, de acuerdo con evaluaciones realizadas por este equipo de investigación,33 en las que también detectaron actividad en los extractos diclorometánico y etanólico38 de dicha especie contra cepas de Candida albicans y Candida krusei, al igual que los mismos extractos de E. azurea.
Los recientes resultados encontrados para B. salicifolius revelan un amplio espectro de actividad antimicrobiana de sus extractos, que sumado a los demás resultados positivos, constituyen un aporte preliminar en la búsqueda de antifúngicos, la que ha alcanzado mucho interés por el aumento de estas infecciones, por ejemplo, en candidemias en algunos hospitales,39 las que se han incrementado más del 500 % en los últimos 30 años, si bien la mortalidad ha disminuido con el uso oportuno de antifúngicos.
Los resultados muestran que las bioactividades encontradas en las especies seleccionadas validan los antecedentes etnobotánicos, a excepción de las especies Castela tweedii, que no mostró actividad en ninguno de los extractos, y Eichhornia azurea que tampoco evidencio actividad en sus extractos acuosos. ]]>
AGRADECIMIENTOS
Se agradece el apoyo brindado por la SICTFRH de la UNER al PID Nº 2110.
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Recibido: 16 de julio de 2009.
Aprobado: 20 de agosto de 2009.
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Ing. Eduardo P. Vivot Lupi. Departamento Ciencias Básicas. Facultad de Ciencias Agropecuarias-UNER. Ruta Nº 11, km 10,5 Oro Verde, Entre Ríos, Argentina. vivot@ciudad.com.ar
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