Evaluación preliminar de la actividad antiviral del extracto de Laurencia obtusa frente a herpesvirus y virus dengue
Preliminary evaluation of the antiviral activity of Laurencia obtuse extract against herpesvirus and dengue virus
Laritza Rojas Pérez,I Mayling Álvarez Vera,II Luis Francisco Morier Díaz,III Olga Valdés Iglesias,IV Gloria del Barrio AlonsoI
I Grupo de Antivirales Naturales. Dpto. de Microbiología y Virología. Facultad de Biología. Universidad de La Habana. Cuba.
II Laboratorio Nacional de Referencia de Arbovirus. Departamento de Virología. Instituto de Medicina Tropical ¨Pedro Kourí¨. La Habana, Cuba. ]]>
RESUMEN
Introducción: los virus del herpes simplex y el virus dengue se encuentran entre los patógenos humanos de mayor importancia dados los altos niveles de morbilidad y mortalidad que provocan. El fallo en el desarrollo de vacunas para ambos virus, así como la ausencia de fármacos para el tratamiento del dengue y el surgimiento de nuevas variantes virales resistentes a las drogas existentes para los herpesvirus, incrementa la necesidad de buscar nuevas fuentes de compuestos con actividad antiviral. En este sentido las algas son una alternativa interesante debido a la diversidad de compuestos con actividad biológica que se han aislado de estos organismos.
Objetivo: evaluar la actividad antiviral in vitro de un extracto hidroalcohólico del alga roja Laurencia obtusa frente a virus herpes simplex tipo1, herpes simplex tipo 2 y virus dengue.
Métodos: se determinó el valor de concentración citotóxica media empleando el ensayo de reducción de MTT en células Vero y C6/36HT. El cálculo de la concentración efectiva media se realizó mediante inhibición del efecto citopático en células Vero o C6/36HT, dependiendo del virus. El índice selectivo se calculó a partir de la relación IS=CC50/CE50.
Resultados: el extracto hidroalcohólico de L obtusa no es tóxico en las células Vero y C6/36HT, en el rango de concentraciones evaluadas. El extracto inhibió la replicación in vitro de los virus HHV 1 y HHV 2 en células Vero con valores de IS>29 y 42, respectivamente. Por otra parte no se observó inhibición de la replicación de DENV-2 en células C6/36HT.
Conclusiones: el extracto hidroalcohólico de L. obtusa posee actividad antiviral frente a HHV 1 y HHV 2 pudiera ser empleado en el desarrollo de fármacos antiherpéticos novedosos. Este trabajo constituye el primer informe sobre la actividad antiviral de esta especie de alga.
ABSTRACT
Introduction: herpes simplex and dengue viruses are the most important human pathogens with high levels of morbidity and mortality. Lack of vaccine development for these viruses, non-existence of drugs for dengue treatment and the emergence of new herpes virus variants resistant to drugs currently in use reinforce the need for new sources of antiviral drugs. Algae remain an interesting alternative in this regard, due to the diversity of compounds with biological activity found in these organisms.
Objective: to evaluate the in vitro antiviral activity of a hydroalcoholic extract of the red seaweed Laurencia obtusa against herpes simplex type 1, herpes simplex type 2 and dengue virus.
Methods: the mean cytotoxic concentration was determined by using the MTT reduction assay in Vero and C6/36HT cells. Mean effective concentration was estimated with the cytopathic effect inhibition in Vero or C6/36HT cells depending on the virus. Selective index (SI) =CC50/EC50 was calculated.
Results: hydroalcoholic extract from L.obtusa was not toxic at the evaluated concentrations The extract managed to inhibit HHV 1 y HHV 2 virus replication in Vero cells with SI values higher than 29 and 42, respectively. On the other hand there was no inhibition of DENV-2 replication in C6/36HT cells.
Conclusions: hydroalcoholic extract from L. obtusa showed in vitro antiviral activity against HHV 1 and HHV 2 and could be employed as a source for new antiviral compounds. This is the first report on the antiviral activity of this alga species.
Keywords: Laurencia obtusa; antiviral; herpes; dengue.
]]> INTRODUCCIÓN
Los virus del herpes simplex y el virus dengue se encuentran entre los patógenos humanos con altos niveles de mortalidad y morbilidad.1 El fallo en el desarrollo de vacunas,2 la ausencia de antivirales para el tratamiento de la infección por virus dengue3 y la aparición de nuevas variantes virales de herpes virus resistentes a las drogas que se encuentran en uso actualmente4 incrementa la necesidad de buscar nuevos antivirales. Las algas constituyen una alternativa para la obtención de nuevas drogas antivirales, considerando la diversidad de metabolitos secundarios con estructuras novedosas descritos en estos organismos. Las condiciones ambientales en las que se desarrollan, las convierten en una fuente muy atractiva para la búsqueda de moléculas de interés farmacológico.5 En los miembros del Phyllum Rhodophyta (macroalgas rojas) se han descritos una gran variedad de compuestos con actividad antiinflamatoria, neuroprotectora, antihelmintos, antioxidante, antitumoral y antibacteriana.6 Adicionalmente los miembros de este Phyllum exhiben actividad antiviral frente a varios virus patógenos de humanos. Metabolitos aislados de varias especies de algas rojas mostraron actividad frente a HHV1 y HHV2 7, VIH8y DENV-2, DENV-3 y DENV-4.9
En este trabajo se evaluó la actividad antiviral in vitro de un extracto hidroalcohólico del alga roja Laurencia obtusa frente a HHV,1 y HHV,2 y DENV-2.
MÉTODOS
MATERIAL A EVALUAR
El muestreo de Laurencia obtusa (Hudson) J.V. Lamouroux, 1813 (Rhodophyta, Rhodomelaceae) se realizó en la zona de arrecife adyacente al Rincón de Guanabo, al noreste de La Habana (23º10'48"N y 82º06'02"E) en el mes de mayo del año 2008.
La colecta se realizó mediante buceo en SCUBA. Posteriormente se procedió a la identificación taxonómica de la especie, autenticada por el Dr. A.J. Areces según Littler y Littler;10 y colocada en el herbario del Acuario Nacional de Cuba (IdO 232). Todas las muestras fueron lavadas con agua de mar, separadas manualmente de epifitas y materias extrañas y conservadas en congelación a -20 °C.
Para la preparación de los extractos, las algas fueron molinadas y homogeneizadas con una solución hidroetanólica (50 %) en una relación 1:10. El extracto fue mantenido a 10 °C, por 72 h con agitación periódica y luego filtrado por lona, centrifugado a 10 000 xg y concentrado en un evaporador rotatorio a 50 °C hasta un nivel de sólido aproximado del 15 %. A continuación fueron secados por liofilización con N2 líquido para su posterior análisis y evaluación de la actividad.
La caracterización fitoquímica preliminar del extracto se realizó según las técnicas descritas por Miranda y Cuéllar11 mientras que el contenido de polifenoles totales fue ejecutado mediante la técnica colorimétrica referida en la Farmacopea Británica12 (BP por sus siglas en inglés) para la determinación de taninos utilizando el pirogalol como patrón de referencia. Para el análisis de los componentes químicos mayoritarios en el extracto se utilizaron los métodos Proteínas solubles por método de Bradford,13 usando Albúmina de Suero Bovino (BSA) como patrón de referencia (1 mg. ml-1), azúcares solubles totales por el método de Fenol-Sulfúrico14 con D(+) galactosa como estándar, lípidos totales por extracción con solventes según Bligh y Dyer15 y su cuantificación colorimétrica por reacción con dicromato de potasio en medio ácido según Craigie y Leigh,16 con el uso de una solución de colesterol como patrón.
]]> VIRUS Y LÍNEAS CELULARESPara la evaluación de la actividad antiviral se emplearon los virus HHV 1 y HHV 2 procedentes de aislamientos clínicos, gentilmente donados por la Dr. María Oña (Servicio de Microbiología, Hospital Universitario Central de Asturias, España) y propagados en la línea celular de riñón de mono verde africano (Vero) (ECACC No. 84113001). Las células Vero se cultivaron en medio Mínimo Eagle Modificado (DMEM) (Gibco BRL) suplementado con 10 % de suero bovino fetal (SFB) (SIGMA). En los ensayos antivirales, las células se mantuvieron en medio DMEM pero sin suero.
Para la evaluación de la actividad antiviral frente al virus dengue se utilizó la cepa A15 (2PR 4P C6/36HT), de virus dengue 2 (DENV-2) obtenida a partir del banco de muestras clínicas del Laboratorio Nacional de Referencia de Arbovirus del Instituto de Medicina Tropical Pedro Kouri (IPK). El virus fue propagado en la línea celular de mosquito C6/36HT (sublínea obtenida a partir de C6/36 que crece a 34 °C) donada por el CDC de San Juan de Puerto Rico al Laboratorio de Cultivos Celulares del IPK. Esta línea crece a 33 °C en medio MEM suplementado con1 % de L-glutamina y 10 % de SFB (SIGMA).
Los virus empleados se titularon mediante un ensayo de punto final 50 % 17 en el que el resultado se expresa como dosis infectiva media en cultivo celular por mililitro (TCID50.mL-1).
ENSAYO DE TOXICIDAD
La determinación de citotoxicidad se realizó mediante el ensayo de reducción del bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-2H-tetrazolio (MTT).18 Se emplearon placas de 96 pocillos de fondo plano con monocapa confluente de células Vero o C6/36HT, sembradas 48 horas antes. El rango de concentraciones evaluadas fue de 1-5 000 µg.mL-1 (siete réplicas por concentración) y las placas se incubaron a 37 °C/33 °C, en atmósfera con 5 % de CO2. Se realizó observación diaria al microscopio invertido con el objetivo de apreciar cambios morfológicos que indicaran toxicidad. Al cabo de las 72 horas se añadió a cada pocillo 10 µL de MTT 5 000 µg.mL-1 disuelto en solución salina tamponada con fosfato (SSTF) (0,01mol-L -1; pH 7). Se agitó levemente y se incubó durante 4 horas a la temperatura de crecimiento de cada línea celular, protegido de la exposición a la luz. Posteriormente se eliminó cuidadosamente todo el contenido de la placa y se disolvieron los cristales de formazán con 100 µL de DMSO por pocillo. La absorbancia se midió a 540 nm con longitud de onda de referencia a 620 nm en un espectrofotómetro lector de placas multipozos (MRX Revelation, Dynex Technologies®) con el programa integrado DynexRevelation 4.02.
El porcentaje de viabilidad celular asociado a cada concentración del extracto se calculó dividiendo el valor medio de la absorbancia de los cultivos tratados con dicha concentración entre el valor medio de absorbancia de los controles de células (sin tratar), los cuales se consideraron el 100 % de viabilidad celular. Se determinó el valor de la CC50 mediante regresión lineal a partir de la ecuación de la línea de tendencia de la curva dosis-respuesta, obtenida al graficar (concentración del extracto-porcentaje de viabilidad celular).
ENSAYO DE ACTIVIDAD ANTIVIRAL
La evaluación primaria de la actividad antiviral del extracto se realizó mediante la lectura de ECP.19 En este ensayo se emplearon placas de 96 pocillos con monocapa celular confluente. Para ello se retiró el medio de crecimiento de la placa y se añadieron 90 µL del extracto cubriendo un rango de concentraciones 0-5 000 µg.mL-1 (no citotóxicas) exceptuando la columna que correspondió al control de virus. Se incubó la placa durante una hora a la temperatura de crecimiento de cada línea celular en atmósfera con 5 % de CO2. Pasado este tiempo se adicionaron 10 μL de virus con 100 TCID50-mL-1 a cada pocillo, exceptuando la columna que correspondió al control de células. Las placas se incubaron a la temperatura de crecimiento, en atmósfera con 5 % de CO2 y se observaron diariamente durante 72 horas. Se determinó para cada concentración del extracto el porcentaje de pocillos con ECP. Se obtuvo el valor de concentración que inhibe la multiplicación viral en el 50 % de los pocillos (CE50) mediante regresión lineal a partir de la ecuación de la línea de tendencia de la curva dosis-respuesta (concentración de extracto-porcentaje de pocillos con ECP).
PROCESAMIENTO DE LOS RESULTADOS
]]> La concentración citotóxica media (CC50) y la concentración efectiva media (CE50), se calcularon mediante análisis de regresión lineal a partir de la ecuación de la línea de tendencia usando las curvas dosis-respuesta generadas a partir de los datos experimentales. Todos los resultados se presentan como valores medios y desviaciones estándar de dos experimentos. En cada caso se calculó el valor del índice selectivo, teniendo en cuenta la relación de la concentración citotóxica media y la concentración efectiva media (IS=CC50/CE50), se consideró IS≥10 como criterio de actividad antiviral.20
RESULTADOS
En el cuadro se muestra la composición cualitativa del extracto en los metabolitos secundarios. Los resultados coinciden si se tiene en cuenta la presencia de terpenos en la fracción lipídica, de los polifenoles entre los que se encuentran los flavonoides. La respuesta a los reactivos de Drangerdoff y Wagner de forma moderada deberá tenerse en cuenta para los resultados del trabajo con L. obtusa por el valor de los alcaloides como compuestos bioactivos.
En la tabla 1 aparece la composición química mayoritaria del extracto, la fracción polisacarídica es predominante así como la fracción lipídica lo que no es común en especies de algas marinas. Se observa también el nivel de polifenoles totales en el extracto de L. obtusa que pueden contribuir también a su actividad antiviral.
La exposición de las células Vero y C6/36HT al extracto durante 72 h no provocó cambios en su morfología en ninguno de los casos, asimismo la relación viabilidad celular-concentraciones del extracto tuvo un comportamiento lineal (figura 1 A y B), con coeficientes de regresión (R2) de 0,881 y 0,991 respectivamente.
El extracto de L. obtusa no mostró toxicidad en ninguna de las dos líneas celulares a las concentraciones evaluadas (0-5 000 µg.mL-1) y se obtuvieron porcentajes de viabilidad celular superiores al 50 %, por lo que se consideró la CC50 como mayor que 5 000 µg.mL-1 en los dos casos.
ACTIVIDAD ANTIVIRAL DEL EXTRACTO DE L. OBTUSA FRENTE A HHV 1, HHV 2 Y DENV-2
Los resultados de los ensayos primarios de actividad antiviral muestran que el extracto L. obtusa posee actividad inhibitoria sobre la multiplicación in vitro de HHV 1 y HHV 2 en células Vero. En la figura 2 se muestran los resultados del ensayo frente a HHV 1 y HHV 2, observándose que se estableció una relación lineal dosis-% de pocillos con ECP, evidenciada con coeficientes de regresión (R2) de 0,857 y 0,866 respectivamente.
]]> La determinación del valor de CE50 empleando la ecuación de la recta mostró valores de 119±27,31 µg.mL-1 para HHV 1 y de 141±2,44 µg.mL-1 para HHV 2 obteniéndose índices selectivos mayores que 10 en ambos casos (tabla 2).El extracto de L. obtusa no mostró actividad inhibitoria de la multiplicación in vitro de virus dengue en células C6/36HT en el intervalo de concentraciones evaluadas, ya que a la mayor concentración de extracto ensayada se observó un 83% de pocillos con ECP.
DISCUSIÓN
En este trabajo se evaluó la actividad antiviral del extracto hidroalcohólico del alga roja L. obtusa frente a HHV 1 y HHV 2 y DENV-2 mediante la reducción del efecto citopático producido por estos virus en células Vero y C6/36HT respectivamente. El extracto no es tóxico para los sistemas celulares utilizados. Varios estudios informan resultados semejantes en la evaluación de citotoxicidad de extractos de algas en varias líneas celulares, con excepción de especies que fueron empleadas en ensayos de actividad frente a líneas tumorales.5 Se observó actividad antiviral del extracto de L. obtusa en cultivo de células (IS≥10)20 frente a HHV 1 y HHV 2 mientras que no se observó actividad antiviral frente a virus dengue. Este trabajo constituye el primer informe de actividad antiherpética de L. obtusa aunque se informa esta actividad en otros miembros del Phyllum Rhodophyta como, Grateloupia indica,21 Scinaia hatei,22 Sphaerococcus coronopifolius y Boergeseniella thuyoides.23 En el caso de la actividad antiviral frente a virus DENV-2 igualmente existen varios informes en algas rojas como Schizymeniabinderi,24 Palisada perfórate,25 Callophyllisvariegata,26 y Cryptonemia crenulata,27 en los que generalmente se asocia la actividad antiviral con la presencia de polisacáridos sulfatados y con la inhibición de la adsorción.
El contenido de polisacáridos solubles totales en L. obtusa es alto, además se conoce que en las algas rojas prevalece la producción de polisacáridos sulfatados como agar y carragenanos que pueden representar hasta el 70 % de su peso seco.27
En este sentido es posible que la ausencia de actividad antidengue este relacionada a las características de los receptores celulares que median el proceso infeccioso en las células C6/36HT. Así hay informes que avalan una susceptibilidad diferencial de las células Vero y las C6/36 HT.9,27
Cabe destacar que dentro de las algas rojas los miembros del género Laurenciase caracterizan por la producción de compuestos halogenados para los que se describe un amplio rango de actividades biológicas,28 y por la presencia de elevados niveles de sesquiterpenos, diterpenos y triterpernos.29 Específicamente en L. obtusa se informa la presencia de C15 acetogeninas con actividad biológica, 30 de sesquiterpenos con actividad antibacteriana y antifúngica,31 actividad antitumoral32 y recientemente se actividad antiviral frente a virus Influenza A y B.33
Los principales mecanismos de actividad antiviral descritos en algas involucran fundamentalmente a moléculas que participan en la etapa de adsorción.34 Sin embargo no debe excluirse la posibilidad de que la acción del extracto se produzca sobre otra etapa del ciclo replicativo viral, teniendo en cuenta que aunque ambos son virus envueltos no se observa actividad frente a virus dengue. Además existen grandes diferencias en el ciclo replicativo de los virus de las familias Herpesviridae y Flaviviridae, lo que hace que las dianas virales susceptibles a inhibición por los compuestos presentes en el extracto sean muy diversas. Estos resultados demuestran que L. obtusa presenta una actividad inhibitoria específica frente a HHV 1 y HHV 2 lo que motiva para otros estudios con el objetivo de investigar su mecanismo de acción y la naturaleza química de los principios activos involucrados en esta actividad. A la vez que precisan estudios antidengue en otras líneas celulares, específicamente de mamíferos.
]]>AGRADECIMIENTOS
Se agradece la colaboración de los miembros del Laboratorio Nacional de Referencia de Arbovirus del IPK, a la Téc. Emidalis Pérez por todo su apoyo en los ensayos de evaluación de actividad antiviral y especialmente a la Téc. Dianeya Mendoza Llanes del Laboratorio de Cultivo de Células del Departamento de Asistencia Científico-Técnica de esta institución por su valiosa colaboración en el trabajo con los cultivos de células C6/36HT.
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Recibido. 7 de septiembre de 2014
Aprobado: 8 de octubre de 2015
Gloria del Barrio Alonso . Grupo de Antivirales Naturales. Dpto. de Microbiología y Virología. Facultad de Biología. Universidad de La Habana. Calle 25, No.455, entre J e I, Vedado, Plaza de la Revolución, Código Postal: 10 400 La Habana, Cuba. Teléfono: 7836 79 41.Correo electrónico: gbarrio@infomed.sld.cu
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