Lic. María de los Ángeles Rios Hernández,1 Dra. María de los Ángeles Melgares Ramos,2 Lic. Maité Hernández Menéndez3 y Dr. Alejandro Joan Figueroa4
El carcinoma epidermoide de células escamosas de la conjuntiva ocupa el segundo lugar en frecuencia de los tumores malignos oculares. Este tumor puede tener una evolución letal si no es diagnosticado y tratado en etapas tempranas. Recientes reportes de la literatura, muestran la presencia del papilomavirus humano 16 (PVH 16) en displasias epiteliales conjuntivales y carcinoma escamoso, este virus puede desempeñar un papel importante en el desarrollo de lesiones benignas y malignas de la conjuntiva. Sin embargo, la información es escasa y contradictoria, por lo que es interés nuestro estudiar un grupo de ellas. Se determinó la presencia de los PVH 16 y 18 por la técnica de PCR, se halló la presencia de los tipos 16 (66,6 %) y 18 (66,6 %) en lesiones premalignas mientras que en las malignas fue del 50 % para el tipo 16 y del 25 % para el tipo 18. Se demostró la existencia de infección viral por papiloma en lesiones de la conjuntiva, con una mayor carga viral en las lesiones premalignas lo que pudiera ser un factor necesario para la transformación maligna en esta localización.
Palabras clave: Carcinoma epidermoide, conjuntiva, papilomavirus.
El cáncer es una enfermedad multifactorial, que agrupa a más de 300 tipos diferentes de tumores. En el ámbito mundial, es la segunda causa de muerte por enfermedad, después de las cardiovasculares. Por la alta tasa de mortalidad que esta enfermedad produce y por su compleja y aún no bien dilucidada patogenia internacionalmente se dedican cifras millonarias al desarrollo de estudios básicos y aplicados con vistas a la adquisición de nuevos conocimientos que permitan la prevención y cura de la misma. ]]>
El carcinoma epidermoide de células escamosas de la conjuntiva ocupa el segundo lugar en frecuencia entre los tumores malignos oculares. Este tumor puede tener un mal pronóstico si no es diagnosticado y tratado en etapas tempranas. Newton y otros mostraron que la incidencia del carcinoma de células escamosas de la conjuntiva disminuía aproximadamente un 49 % por cada 10º de incremento en latitud. Por ejemplo, Uganda muestra 12 nuevos casos por millón de habitantes por año mientras que Inglaterra presenta una incidencia de 0,2 nuevos casos por millón de habitantes por año.1 En estudios realizados en Estados Unidos, la incidencia fue de 0,3 pacientes por millón de habitantes por año. En nuestro país, la incidencia es aproximadamente de 12 a 15 nuevos casos por año.2
Recientes reportes de la literatura han detectado la presencia del papilomavirus humano (PVH) en estos tumores. 3,4
El PVH es una familia de virus que despierta el interés de la comunidad científica que trabaja en el campo de la oncología por su asociación con lesiones premalignas y malignas en piel y mucosas. Hasta el momento, han sido detectados alrededor de 200 tipos de estos virus y, según su poder oncogénico, ellos son clasificados como de alto y bajo riesgo de desarrollar cáncer. Los tipos de alto riesgo más conocido son: PVHs 16, 18, 45, 31, 52, 33, 58, 35, 59, 51, 56, 39, 68, 73 y 82 (IS39/W13B, MM4). En la actualidad se reconocen a los PVHs 16 y 18 como agentes etiológicos del cáncer cérvico uterino 4-6 y muy asociados a lesiones pre- malignas y malignas del tracto anogenital, así como a otras localizaciones como son: boca, laringe, faringe, colon y ojo, fundamentalmente.7,8 Los PVHs de bajo riesgo se encuentran asociados a lesiones benignas y premalignas de bajo grado y los tipos más frecuentes son el 6 y el 11.
Es amplia la literatura existente con respecto a estudios sobre la infección por estos virus y su asociación con lesiones neoplásicas de diferentes localizaciones. Sin embargo, son escasos y contradictorios los reportes sobre la infección por PVH en la conjuntiva ocular. Se piensa que esto es por la baja incidencia de estos tumores así como la delicada situación anatómica que presenta la localización ocular, en la cual para la obtención de muestras es necesario que el paciente tenga criterio quirúrgico. No obstante, una vez que esto se cumple, el fragmento de tejido que se obtiene es de muy pequeño tamaño, lo cual dificulta el trabajo con la muestra.
Hay autores que han planteado la asociación existente entre ciertas lesiones de la conjuntiva y la presencia de infección por virus oncógenos, como son el virus del herpes simple (HSV) y el papilomavirus humano (PVH) en el pterigium. A pesar de que otros factores como la exposición a la luz solar y la historia familiar son muy importantes, la eliminación de estos agentes virales podría contribuir al tratamiento de lesiones tan recidivantes.9-12 Muchos autores especulan acerca de la posibilidad de que la infección por PVH sea la causa de la recurrencia del pterigium posexcisión, aunque son muchos los estudios necesarios para demostrar esta hipótesis.13- 15 ]]>
La contaminación de la conjuntiva por el virus del papiloma se plantea que puede ocurrir en el momento del parto cuando el feto pasa por la vagina en aquellas mujeres con infección genital o por autoinoculación al tener infectados los dedos de las manos.2, 10
El objetivo global de todas las investigaciones de la relación virus-cáncer es la prevención. Muchos esfuerzos están encaminados a demostrar esta relación, desarrollar métodos de diagnóstico más sensibles y terapéuticas eficaces para detectar y eliminar el virus y lesiones premalignas en programas preventivos, antes del establecimiento de la malignidad, de esta forma se gana una gran parte de la batalla contra el cáncer.
En este trabajo nos proponemos determinar la infección por PVH en pacientes con lesiones de la conjuntiva lo cual nos permitirá profundizar en el estudio de la patogenia de esta enfermedad, y de esta manera contribuir al entendimiento de la asociación de los papilomavirus humanos con la aparición de lesiones preneoplásicas y neoplásicas de la conjuntiva ocular en el hombre.
Se seleccionaron 15 pacientes atendidos en la Consulta de Oftalmología del Instituto Nacional de Oncología y Radiobiología, 3 de ellos presentaron lesiones premalignas (1 leucoplasia y 2 pterigium) y los 12 restantes presentaron lesiones malignas (carcinoma epidermoide). Las muestras para el estudio fueron tomadas durante el acto quirúrgico, las mismas se congelaron -70 °C hasta su uso.
La purificación del ADN se realizó por el método de fenol- cloroformo.16 La amplificación de las secuencias de ADN fue llevada a cabo mediante la reacción en cadena de la polimerasa (RCP) según Jacobs y otros.17 Se emplearon los cebadores generales Gp5+/6+, los cuales amplifican un fragmento de 140 pb del gen L1 de HPV.18 Como control positivo se utilizó el ADN de las células HeLa y como control negativo se usó agua bidestilada estéril.
La cepa de E. coli MC1061 fue transformada con los plásmidos que tienen clonados los genomas completos de los HPVs 16 y 18 mediante el método del cloruro de calcio. Las bandas de cada uno de los PVH fueron extraídas mediante digestiones con enzimas de restricción, y corridas electroforéticas en gel de bajo punto de fusión LGT.18
El ADN de cada una de las muestras (1mg) así como del control negativo (1mg de ADN leucocitario humano) y control positivo (50 pg de los genomas completos de los PVH 16, 18), previamente desnaturalizadas, fueron fijadas a los filtros de Hybond N+ siguiendo la recomendación de los productores. Las membranas fueron hibridadas con cada una de las sondas (genomas completos de los HPV 16, y 18) marcadas mediante un método no radiactivo (ECL, Amersham) y la señal fue detectada mediante autorradiografía (Hyperfilm, ECL).
Los resultados del tipaje por Dot blot se muestran en las tablas 1, 2 y 3, donde se puede observar que las 3 muestras premalignas estudiadas fueron positivas al PVH. De los 2 pterigium utilizados en el estudio, uno presentó el genotipo 16 solamente mientras que el otro mostró una coinfección por ambos tipos de PVH de alto riesgo. La muestra de leucoplasia mostró infección con el PVH 18 (tablas 1, 2 y 3).
Tabla 1. Detección de PVH mediante la técnica de reacción en cadena de la polimerasa
| Tipo de lesión | ]]> Número de casos | Casos positivos | % de positividad |
| Premalignas | 3 | 3 | 100 |
| Malignas | 12 | 9 | 75 |
| Total | 15 | ]]> 12 | 80 |
Tabla 2. Determinación del tipo viral 16 mediante la técnica de hibridación de ácidos nucleicos Dot blot
| Tipo de lesión | Número de casos | Casos positivos | % de positividad |
| Premalignas | 3 | 2 | 66,6 |
| Malignas | 12 | ]]> 6 | 50 |
| Total | 15 | 8 | 53,3 |
Tabla 3. Determinación del tipo viral 18 mediante la técnica de hibridación de ácidos nucleicos Dot blot
| Tipo de lesión | Número de casos | Casos positivos | % de positividad |
| Premalignas | 3 | ]]> 2 | 66,6 |
| Malignas | 12 | 3 | 25 |
| Total | 15 | 5 | 33,3 |
En 9 de las 12 muestras correspondientes a tumores malignos de la conjuntiva (carcinoma epidermoide) se observó la presencia viral (fig.). Al realizar la hibridación con las sondas correspondientes de PVH se observó que 6 de las 9 muestras positivas a la RCP presentaron el genotipo 16 de alto riesgo mientras que las 3 muestras restantes estaban infectadas con el genotipo 18, también de alto riesgo (tablas 1, 2 y 3).
Fig. Resultado de la reacción en cadena de la polimerasa utilizando los cebadores Gp5/6. M: Marcador de peso molecular (D 9655 Sigma (pBR322/Hae III). Carril 1: Muestra 1. Carril 2: Muestra 2. Carril 3: Muestra 3. Carril 4: Muestra 4. Carril 5: Muestra 5. Carril 6: Muestra 6. Carril 7: Muestra 7. Carril 8: Muestra 8. Carril 9: Muestra 9. Carril 10: Muestra 10. Carril 11: Muestra 11. Carril 12: Muestra 12. Carril 13: Muestra 13. Carril 14: Muestra 14. Carril 15: Muestra 15. Carril 16: Control positivo (ADN de células HeLa). Carril 17: Control negativo (agua bidestilada estéril). Las muestras 1-3 son premalignas. Las muestras 4-15 son malignas.
Poco se sabe de la posible relación entre la infección por estos virus y la aparición de los tumores conjuntivales, los reportes aparecidos en la literatura en esta localización son escasos y contradictorios. Algunos autores han detectado la presencia del PVH en lesiones premalignas de la conjuntiva, pero no así en las lesiones malignas estudiadas, por lo que estos autores han planteado que el virus no parece desempeñar un papel determinante en la aparición del cáncer conjuntival, por lo que se plantea la existencia de otros mecanismos involucrados en la carcinogénesis, como pudiera ser la luz solar.19,20
Contrario a esto, otros investigadores plantean la presencia de la infección viral por los tipos PVH 16 y el 18 en tumores epiteliales de la conjuntiva, con una alta expresión de sus proteinas oncógenas.21-24 Otros reportes señalan también la presencia del PVH 33 asociado a lesiones malignas.25 De forma general, en los estudios realizados al nivel mundial se ha podido detectar la presencia de los PVHs en lesiones premalignas conjuntivales, tanto de los catalogados de alto riesgo, 16,18 y 33, así como los de bajo riesgo, 6 y 11.
Nuestros resultados coinciden con lo planteado por aquellos investigadores que han encontrado los tipos virales 16 y 18, ya que en nuestro estudio detectamos ambos tipos, y fue el PVH 16 el más frecuente. Sin embargo, aquellos tumores que no fueron positivos a la presencia del PVH 16 y 18 no los podemos considerar negativos al PVH, ya que los mismos pueden estar infectados por otros tipos virales oncogénicos diferentes a los estudiados por nosotros.
Un aspecto importante a discutir de nuestros resultados es la diferencia observada en la intensidad de la señal en el Dot blot, correspondiente a la cantidad de genomas virales presentes en la muestra, la cual fue mucho más intensa en las lesiones premalignas que en las malignas. Esto pudiera sugerir que, en las lesiones premalignas, para que ocurra la transformación maligna, pudiera ser un factor necesario una mayor carga viral, aspecto que debe ser demostrado en estudios con un mayor número de muestras.
Atendiendo a la historia natural de la infección por estos virus, la cual transita desde un tejido normal infectado por PVH hasta lesiones premalignas de diferentes grados y estas a su vez al cáncer, es de gran importancia realizar un diagnóstico temprano de dicha infección en las lesiones cuyos tejidos no han sido totalmente transformados como un modo de prevenir la malignidad, al aplicarle a dichos pacientes un tratamiento capaz de eliminar la presencia del virus.
The epidermoid squamous cell carcinoma of the conjunctiva occupies the second place in frequency among the occular malignant tumors. This tumor may have a lethal evolution if it is not diagnosed and treated early. Recent reports of literature show the presence of human papillomavirus 16 (HPV) in conjunctival epithelial displasias and squamous cell carcinoma. This virus may play an important role in the development of bening and malignant lesions of the conjunctiva. However, the information is scarce and contradictory and that´s why we are interested in studying a group of them. The presence of HPV16 and 18 was determined by using the PCR technique. Types 16 (66.6 %) and 18 (66.6 %) were found in premalignant lesions, whereas 50% of type 16 and 25 % of type 18 were observed in malignant lesions. It was proved the existance of viral infection due to papilloma in conjunctiva lesions, with a higher viral burden in the premalignant lesions, which may be a necessary factor for the malignant transformation in this localization.
Key words: No tiene
1. Newton RA. Review of the etiology of squamous cell carcinoma of the conjunctiva. Br J Cancer 1996; 74:1511-3.
2. Devron H, Char MD. Tumours of the eye and ocular adnexa. Atlas of Clinical Oncology. 2001.
3. Sjo NC, Heegaard S, Prause JU, von Buchwald C, Lindeberg H. Human papillomavirus in conjunctival papilloma.Br J Ophthalmol 2001;85(7):785-7.
4. Palazzi MA, Erwenne CM, Villa LL. Detection of human papillomavirus in epithelial lesions of the conjunctiva. Sao Paulo Med J 2000;118(5):125-30.
5. Bosch FX, Lorincz A, Muñoz N, Meijer CJ, Shah KV. The causal relation between human papillomavius and cervical cancer. J Clin Pathol 2002;55:244-65.
6. Muñoz N, Bosch FX. Current views on the role of Human Papillomavirus in the Genesis of Cervical Neoplasia. Papillomavirus report 1991;2(3):
7. Clifford GM, Smith JS, Plummer M, Muñoz N, Franceschi S. Human papillomavirus type in invasive cervical cancer worlwide: a metaanalysis. Br J Cancer 2003;88: 63-73.
8. Gillison ML, Shah KV. Human papillomavirus - associated head and neck squamous cell carcinoma: mounting evidence for an etiologic role for HPV in a subset of head and neck cancers. Curr Opin Oncol 2001;13:183-8.
9. Franceschi S, Bidoli E, Herrero R, Muñoz N. Comparison of cancers of the oral cavity and pharynx worldwide: etiological clues. Oral Oncol 2000;36:106-15.
10. Newton R, Ziegler J, Ateenyi-Agba C, Bousarghim L, Cassabonne D, Beral V, et al. The epidemiology of conjunctival squamous cell carcinoma in Uganda. Br J Cancer 2002;87:301-8.
11. McDonnell J, Wagner D, Ng S, Bernstein G, Sun Y. Human papillomavirus type 16 DNA in ocular and cervical swab of women with genital tract condylomata. Am J Ophthalmol 1991;112:61-6.
12. Boxman IL, Russell A, Mulder LH, Bavinck JN, ter Schegget J, Green A. Association between epidermodysplasia verruciformis-associated human papillomavirus DNA in plucked eyebrow hair and solar keratoses. J Invest Dermatol 2001;117(5):1108-12.
13. Detorakis ET, Drakonaki EE, Spandidos DA. Molecular genetic alterations and viral presence in ophthalmic pterygium. Int J Mol Med 2000;6(1):35-41.
14. Detorakis ET, Sourvinos G, Spandidos DA. Detection of herpes simplex virus and human papilloma virus in ophthalmic pterygium. Cornea 2001;20(2):164-7.
15. Gallagher MJ, Giannoudis A, Herrington CS, Hiscott P. Human papillomavirus in pterygium. Br J Ophthalmol 2001;85(7):782-4.
16. Dushku N, Hatcher SL, Albert DM, Reid TW. p53 expression and relation to human papillomavirus infection in pingueculae,pterygia, and limbal tumors. Arch Ophthalmol 1999;117(12):1593-9.
17. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning: a laboratory manual. USA. Cold Spring Harbor Laboratory, 1989.
18. Jacobs MV, Snijders PJ, van den Brule AJ. A general primer GP5+/6+-mediated PCR-enzyme immunoassay method for rapid detection of 14 high-risk and 6 low-risk human papillomavirus genotypes in cervical scrapings. J. Clin Microbiol 1997;35: 791-5.
19. Qu W, Jiang G, Cruz Y, Chang CJ, Ho GY, Klein RS, et al. PCR detection of human papillomavirus: comparison between MY09/MY11 and Gp5+/6 + primer systems. Jclin Microbiol 1997;35:1304-10.
20. Monescillo J, Mencia-Gutierrez E, Gutierrez-Diaz E, Santos-Briz A, Rodriguez-Peralto JL. .Eyelid verrucous carcinoma. Eur J Ophthalmol 2002;12(5):432-4.
21. Scott IU, Karp CL, Nuovo GJ.Human papillomavirus 16 and 18 expression in conjunctival intraepithelial neoplasia. Ophthalmology 2002;109(3): 542-7.
22. Dithmar S, Schutt F, Volcker HE. [Papillary plica/caruncle tumor. Squamous epithelial carcinoma of the conjunctiva associated with human papillomavirus type 16]. Ophthalmology 2002;99(2):118-9.
23. Buggage RR, Smith JA, Shen D, Chan CC. Conjunctival papillomas caused by human papillomavirus type 33. Arch Ophthalmol 2002;120(2):202-4.
24. Gillison ML, Shah KV. Chapter 9: Role of mucosal human papillomavirus in nongenital cancers. J Nat Cancer Inst Monogr 2003;(31):
25. Eng HL, Lin TM, Chen SY, Wu SM, Chen WJ. Failure to detect human papillomavirus DNA in malignant epithelial neoplasms of conjunctiva by polymerase chain reaction. Am J Clin Pathol 2002;117(3):429-36.
Recibido:8 de julio de 2004. Aprobado:9 de septiembre de 2004.
Lic. María de los Ángeles Rios Hernández. Instituto Nacional de Oncología y Radiobiología. Laboratorio de Biología Molecular. Departamento de Investigaciones. Calle 29 y F, El Vedado, Ciudad de La Habana, Cuba.
1 Licenciada en Biología. Jefa del Laboratorio de Biología Molecular.
2 Especialista de I Grado en Oftalmología. Servicio de Oftalmología Oncológica.
3 Licenciada en Bioquímica. Laboratorio de Biología Molecular. ]]>
4 Especialista de I Grado de Anatomía Patológica. Departamento de Anatomía patológica.