Dr. Iván Hernández García,1 Dra. Araceli Lantigua Cruz2 y Lic. Yadira Hernández Pérez3
Se realizó el estudio de 50 varones con retraso mental y/o autismo de etiología desconocida a fin de detectar individuos afectados con el síndrome frágil X a través del análisis inmunohistoquímico y caracterizarlos clínica y molecularmente. Entre los casos pesquisados se detectaron 3 individuos con baja expresión de la proteína relacionada con el síndrome, a quienes se les realizó la caracterización molecular. La correlación inmunohistoquímica y molecular en 2 de ellos fue positiva. La no correlación de un tercero sugiere que pudiera tratarse de una mutación puntual o una deleción del gen relacionado con la enfermedad. En otro paciente con el fenotipo neuropsicológico y físico característicos de la enfermedad se observó una expresión promedio normal baja, lo que motivó la indicación de la caracterización molecular, que resultó ser positiva. Se discuten los mecanismos genéticos y fisiopatológicos que pudieran explicar la presencia de la proteína en las células analizadas.
Palabras clave: síndrome Frágil X, análisis inmunohistoquímico.
El síndrome frágil X (SFX) es la causa hereditaria más frecuente de retraso mental (RM) conocida.1 La mutación causal es una amplificación de repeticiones trinucleotídicas CGG en la porción terminal 5´ del gen relacionado con la enfermedad (FMR 1). Las personas no afectadas presentan entre 6 y 54 repeticiones CGG. Los portadores de premutación tienen entre 43 y 200 repeticiones y los sujetos afectados más de 200 repeticiones en sus genes, la llamada mutación completa. Esta última expansión se acompaña de hipermetilación de los trinucleótidos, lo que impide la transcripción del gen FMR 1 y por supuesto provoca diminución de la proteína relacionada con la enfermedad (FMRP 1). El clonaje del gen permitió el desarrollo de una técnica inmunohistoquímica capaz de poner en evidencia la ausencia de esta proteína en los linfocitos y otras células de los sujetos con la enfermedad.2,3 El procedimiento es muy útil para la identificación de los varones afectados. Este aventaja a otros procederes diagnósticos por su sencillez y rapidez de aplicación. Teniendo en cuenta la posibilidad de obtener un rápido resultado se decidió aplicar en el pesquisaje de individuos con RM de etiología desconocida, con el objetivo de lograr la caracterización clínica y molecular de los casos detectados, su seguimiento adecuado y el asesoramiento genético de las familias afectadas.
Se aplicó el análisis a una muestra de 50 individuos varones clasificados como RM a causa de factores prenatales no conocidos o con sospecha clínica, citogenética o familiar del síndrome (RM ligado al cromosoma X), a pacientes con RM y/o autismo, así como en los que no se recogieron antecedentes de daño pre, peri o posnatal como causa del RM y que resultaron inclasificables. Se realizó una extensión de sangre periférica obtenida por punción de la yema del pulgar en lámina portaobjeto. El procesamiento posterior de estas se realizó según los requisitos de estas preparaciones (anexo). El paso más importante que es la inmunodetección con el anticuerpo monoclonal se realizó por incubación durante toda la noche. Las láminas fueron examinadas al microscopio de luz por más de un investigador2 para determinar la positividad o no del sistema de inmunodetección según los criterios de Willensen y otros.3 Ambos conteos fueron promediados para obtener un resultado único y reducir la probabilidad de error. Se consideró el AIH positivo cuando se detectó 42 % o menos de los linfocitos proteína positivo. Aquellos casos con 43 % o más de los linfocitos proteína positivo no se consideraron individuos afectados con el SFX. Un linfocito se consideró proteína positivo cuando se observó al microscopio de luz un halo carmelita en el citoplasma de la célula. A los casos positivos les fue aplicado el estudio molecular directo por el método de Southern Blot (SB) para la determinación de las mutaciones según los procedimientos usuales.4
Del total de sujetos pesquisados (n =50) se detectaron 3 individuos con baja expresión proteica cuyos promedios fueron 12; 5 y 11%. La media obtenida entre los casos negativos (n = 47) fue de 82 %. De los 3 sujetos AIH positivos, 2 tuvieron resultados positivos al estudio molecular, y uno resultó negativo, por lo cual se le repitió el AIH en 2 láminas más. Este análisis arrojó baja expresión de la proteína (10 %) en una de ellas y la otra resultó no útil. En uno de los sujetos con un porcentaje de expresión dentro del rango normal, que presentaba todas las características clínicas del SFX, se decidió extraer sangre para estudio molecular. Este individuo resultó ser portador de una mutación completa del gen FMR 1.
Casos 1 y 2. Los sujetos positivos al AIH y al estudio molecular presentaban el fenotipo Martín - Bell. Uno de ellos tenía la mutación completa más la premutación (mosaico para la talla). El otro caso era portador solamente de la mutación completa. Estos individuos constituyen el prototipo de la mayoría de los casos detectados con la enfermedad en el ámbito mundial y reportados en nuestro medio. El fenotipo de ambos muestra RM ligero, las orejas grandes y despegadas, la cara alargada y el componente autista dado fundamentalmente por mirada huidiza y la conducta tímida. En ninguno de estos individuos se encontró trastornos de la refracción ni estrías en la piel. Tampoco presentaron macroorquidismo, aunque debe señalarse que los 3 estaban en edad prepuberal. Ambos habían sido valorados en Psiquiatría por síndrome hiperquinético y por retraso del lenguaje, y uno de ellos comenzó a presentar epilepsia a partir de los 3 años de edad.
En el primero de los casos, que presentaba la mutación completa y la premutación (mosaicismo), el porcentaje de expresión proteica fue superior como promedio (12 %) al del individuo con mutación completa (5 %) Esto se debe a que en el primer caso, se hallaron células con premutación (mosaico para la talla de la mutación) y como es sabido estas células son capaces de producir proteína. ]]>
Caso 3. Este paciente, con baja expresión proteica (11%), que no reflejaba las características fenotípicas y cuyo estudio molecular fue negativo, pudiera mostrar una mutación puntual o una deleción del gen FMR-1. Este niño, de 3 años de edad, presentaba desviación hacia arriba de las fisuras palpebrales, orejas asimétricas con conchas estrechas, raíz de antihélix vertical y poco enrrollamiento del hélix, hernia inguinal y umbilical, RM ligero, trastornos del lenguaje y conducta autista según la evaluación psiquiátrica previa. Fue operado de estenosis hipertrófica del píloro y criptorquidia. El cariotipo previo realizado fue normal (46,xy). El AIH en una primera lámina arrojo 11 % de expresión proteica. En la segunda lámina, después de realizado el SB que resultó negativo, se encontró marca en solo el 10 % de las células. La tercera resultó no útil. La no correlación entre el resultado del AIH y el estudio molecular, nos sugirió que pudiera tratarse de una mutación puntual o una deleción del gen FMR-1. Existen algunas características del cuadro clínico de este paciente, además de la conducta autista descrita, que se han relacionado con el SFX. Entre estas tenemos la criptorquidia y los defectos del tejido conectivo, expresados en este paciente por las hernias inguinal y abdominal. Aunque los casos con deleción reportados en la literatura médica, que se acompañan de déficit de FMR-1, generalmente muestran el fenotipo frágil x clásico; no podemos descartar la posibilidad de una deleción, pues también han sido descritos casos sin este fenotipo.5 Este paciente debe ser estudiado nuevamente a fin de lograr su caracterización molecular.
Caso 4. En relación con el cuarto paciente cuyo resultado al AIH arrojó una expresión proteica dentro del rango normal, no dudamos nunca que tuviera la enfermedad, ya que presenta un hábito longilíneo con cara alargada, orejas grandes y despegadas ligeramente, RM ligero y componente autista dado por una conducta tímida y mirada huidiza. Además, presenta trastornos del lenguaje que se manifiesta por déficit en las habilidades conversacionales con discrepancia entre el nivel del lenguaje y la edad cronológica. Este niño nació con una talla de 51 cm y durante su desarrollo se ha mantenido entre el 90 y 97 percentil de crecimiento. Desde los 3 años se atiende en Psiquiatría adonde se remitió por su conducta hiperquinética y para lo cual fue medicado con las drogas usuales en estos casos. También fue atendido por la especialidad de Oftalmología por trastornos visuales y Otorrinolaringología por otitis recidivantes.
La mayoría de las características señaladas concuerdan con los patrones de crecimiento y desarrollo de esta enfermedad, y los problemas médicos que ha presentado este paciente, también se recogen en la mayoría de los casos afectados.6
El resultado negativo al AIH, pudiera estar en relación con un mosaicismo para la metilación (cuestión que no fue especificada en los resultados), ya que no se encontró mosaicismo para la talla (el paciente presentaba mutación completa). El mosaicismo es muy frecuente en esta enfermedad, a tal punto que aún en tejidos tan especializados como el cerebro existen variaciones significativas en el grado de metilación y por tanto de expresión proteica de sus células. Investigaciones recientes7 podrían resultar muy útiles para la correlación entre las áreas neuroanatómicas afectadas y la sintomatología de estos sujetos. Estos trabajos sugieren que la raíz del cabello es un mejor predictor del estado de la metilación y por ende del grado de discapacidad mental a causa del similar origen de estas células y las neuronas. De Vries y otros han encontrado que individuos con mutación completa presentan hasta un 67 % de células no metiladas, cuya expresión en sangre solo alcanza el 20 % de proteína y sin embargo parece correlacionarse mejor con el 67 % de expresión detectado en la raíz del cabello. Aunque, según nuestro modesto criterio, su mayor ventaja no radicaría en el hecho de que pueda predecir o no el grado de RM (cosa ya bien difícil al tratarse de una cualidad biológica influida por numerosas variables), es indudable que con el estudio del cabello podría ganarse en sensibilidad y especificidad y así poder dar desarrollo a un pesquisaje en cascada que permita detectar la mayor cantidad de personas en riesgo de transmitir la enfermedad.
Análisis inmunohistoquímico.
50 males with mental retardation and/or autism of unknown etiology were studied aimed at detecting individuals affected with the Fragile X syndrome by the immunohistochemical analysis and at characterizing them from the clinical and molecular point of view. Among the screneed subjects, 3 individuals with low expression of the protein related to the syndrome were detected. Molecular characterization was performed in these cases. The immunohistochemical and molecular correlation was positive in 2 of them. The non correlation of the third suggests that it may be a punctual mutation or a deletion of the gene connected with the disease. In another patient with the neuropsychological and physical phenotype characteristic of the disease, it was observed an average normal low expression that led to the indication of the molecular characterization, which proved to be positive. The genetic and physiopathological mechanisms that could explain the presence of the protein in the analyzed cells are discussed.
Key words: Fragile X syndrome; immunohistochemical analysis.
Recibido: 14 de diciembre de 2003. Aprobado: 12 de abril de 2004.
Dr. Iván Hernández García. Hospital Pediátrico Universitario "William Soler", San Francisco y Perla, Altahabana, Ciudad de La Habana, Cuba.
1Especialista de I Grado en Genética Clínica. Hospital Pediátrico Universitario "William Soler".
2Especialista de II Grado en Genética Clínica. Doctora en Ciencias Médicas. Centro Nacional de Genética Médica. ]]>
3Departamento de Biología Molecular. Centro Nacional de Genética Médica.