Instituto Superior de Ciencias Médicas de La Habana. Centro de Investigaciones Biomédicas (CIBIOMED)
Lic. Reinaldo Gutiérrez,1 Lic. Enna Gutiérrez,2 Dra. Bárbara Barrios3 y Dra. Ligia Marcos4
La fenilcetonuria es una enfermedad autosómica recesiva causada por mutaciones en el gen de la enzima fenilalanina hidroxilasa. Posee un amplio espectro fenotípico, que depende principalmente de la actividad residual de la enzima. Objetivos: Determinar la correlación genotipo-fenotipo bioquímico en pacientes a los que se les conoce su genotipo, de acuerdo con la actividad residual de la enzima mutada expresada in vitro, según la base de datos del gen (http://www.mcgillca/pah/db). Métodos: Evaluamos los datos bioquímicos y moleculares de 23 hiperfenilalaninémicos. Se tomó en cuenta la concentración de fenilalanina al nacimiento y la tolerancia a la fenilalanina a los 5 años de iniciado el tratamiento, así como la actividad residual in vitro , de cada una de las mutaciones. Resultados: De acuerdo con la base de datos del gen de la enzima fenilalanina hidroxilasa y los parámetros mencionados anteriormente, 12 pacientes resultaron tener mutaciones severas, 10 intermedias y 1 benigna. Nuestro estudio mostró que existe coincidencia genotipo-fenotipo bioquímico en el 78,2 % de los individuos con fenilcetonuria estudiados. Se demostró que las mutaciones en el gen de la fenilalanina hidroxilasa son el factor principal en la determinación del fenotipo metabólico en los pacientes con hiperfenilalaninemia.
Palabras clave: Hiperfenilalaninemia, fenilcetonuria, genotipo, fenotipo, fenilalanina hidroxilasa.
En Cuba, desde 1984 se inició el Programa Nacional de Prevención de la Fenilcetonuria, según el cual se estudian a todos los recién nacidos mediante el método de Guthrie.3 Los niveles de expresión in vitro de la actividad enzimática residual, obtenidos para las distintas mutaciones, han sido muy útiles para examinar la severidad de las encontradas en Cuba.4
]]> En este trabajo nos propusimos determinar el grado de coincidencia entre el fenotipo bioquímico esperado y el observado en 23 pacientes cubanos con FCU. A estos se les pudo determinar las mutaciones en los alelos, teniendo en cuenta la actividad de la enzima fenilalanina hidroxilasa in vitro y la reportada en la base de datos para este gen (http://www.mcgillca/pah/db).Los pacientes fueron 23 niños y adolescentes con cifras de fenilalanina superior a los 3,5 mg / dL (210 µmol / L), atendidos en el Hospital Pediátrico de Centro Habana y el Hospital Pediátrico de Holguín, y fueron caracterizados molecularmente, mediante una colaboración entre el Centro Nacional de Genética Médica y el Centro de Biología Molecular de la Universidad Autónoma de Madrid.
Se utilizó la metodología PCR-Broad Range DGGE (electroforesis en geles de gradientes desnaturalizantes de rango amplio) y luego secuenciación con un equipo ALF Express Sequencer de Amersham y estuche de reactivos de PROMEGA.5
Para el estudio de correlación genotipo-fenotipo bioquímico, se utilizaron los parámetros siguientes: niveles de fenilalanina al diagnóstico, la tolerancia a la fenilalanina después de 5 años de iniciado el tratamiento, la actividad residual predictiva de la enzima mutada y el tipo de mutación.
El estudio de mutaciones del gen de la fenilalanina hidroxilasa en los 23 pacientes cubanos seleccionados, ha sido realizado con anterioridad.6
Clasificación fenotípica de los pacientes
A los 23 pacientes a los que se les pudo completar la caracterización molecular, se les clasificó, como muestra la tabla 1, en 3 grupos fenotípicos: FCU clásica, FCU intermedia e Hiperfenilalaninemia persistente .
Tabla 1. Distribución de los pacientes estudiados según el fenotipo bioquímico
]]>|
| Fenilalanina plasma | No. de casos | Porcentaje |
| FCU severa | > 1200 µmol / L | 12 | 52 % |
| FCU intermedia | ]]> 600 - 1200 µmol / L | 10 | 43 % |
| Hiperfenilalaninemia persistente | < 600 µmol / L | 1 | 4,3 % |
Correlación genotipo-fenotipo bioquímico
Al grupo de hipefenilalaninémicos cubanos a los cuales se les determinó el genotipo mediante la técnica de PCR-Broad Range DGGE y secuenciación, se les analizó la correlación genotipo-fenotipo bioquímico, de acuerdo a la base de datos del gen de la fenilalanina hidroxilasa y de la expresión in vitro de la enzima mutada, al fenotipo resultante en homocigóticos y heterocigóticos y a la propia naturaleza de la mutación. Se encontró un porcentaje de coincidencia entre lo esperado y lo observado del 78,2 % (tabla 2).
]]> Tabla 2. Fenotipos metabólicos esperados y fenotipos observados en 23 pacientes con hiperfenilalaninemias| Fenotipo | Esperados | Observados | % de coincidencia |
| Clásico > 1 200 µmol / L | 17 | 12 | ]]> 70 |
| Intermedio > 480 < 1 200 µmol / L | 5 | 10 | 50 |
| Benigno > 180 < 480 µmol / L | 1 | 1 | ]]> 100 |
| Total de coincidencia | 18 de 23 para el 78,2 % | ||
El 74 % de los hiperfenilalaninémicos cubanos estudiados son heterocigóticos compuestos para dos mutaciones diferentes; el 26 % restante corresponde a homocigóticos. En las tablas 3 y 4 se recogen los datos del genotipo y el fenotipo bioquímico de ambos grupos.
Tabla 3. Relación entre genotipo y fenotipo bioquímico en pacientes cubanos homocigóticos para una mutación
| Alelo 1 | Alelo 2 | ARP (%) | Fenilalanina al diagnóstico (µmol/L) | ]]> Tolerancia a la fenilalanina (mg/día) | Fenotipo |
| R261Q | R261Q | 27 | 991 | 442 | Intermedio |
| E280K | E280K | ]]> 1 | 1 750 | 338,8 | Clásico |
| I65T | I65T | 26 | 1 114 | 625,4 | Intermedio |
| ]]> R176X | R176X | ? | 1 083 | 489 | Intermedio |
| E280K | E280K | 1 | 988,6 | ]]> 388,8 | Intermedio |
| E280K | E280K | 1 | 739,2 | No tto. | Intermedio |
]]>ARP: Actividad residual predicha de la enzima in vitro; No tto.: No tratamiento
| Alelo1 | Alelo 2 | ARP (%) | Fenilalanina al diagnóstico (µmol/L) | Tolerancia a la fenilalanina (mg/día) | Fenotipo |
| R158Q | ]]> IVS10 | ?/0 | 1 548 | ND | Clásico |
| IVS10 | R176X | 0/? | 84 | ND | ]]> Intermedio |
| R261Q | IVS10 | 27/0 | 1 452 | 360 | Clásico |
| V388M | S349P | 43/? | ]]> 1 824 | ND | Clásico |
| R261Q | R68S | 27/98 | 1 248 | 135 | Clásico |
| R261Q | ]]> R252W | 27/0,5 | 1 320 | 350 | Clásico |
| F39L | R408W | ?/2,7 | 1 413 | 335 | ]]> Clásico |
| R252W | IVS12 nt1g-a | 0,5/1 | 840 | 358 | Intermedio |
| R261Q | E280K | 27/1 | ]]> 852 | 308 | Intermedio |
| R261Q | E280K | 27/1 | 1 041 | 182 | Intermedio |
| IVS10 | ]]> V388M | 0/43 | 1 488 | 332 | Clásico |
| R252W | R68S | 0,5/98 | 945 | 340 | ]]> Intermedio |
| V388M | E280K | 43/1 | 1 554 | 330 | Clásico |
| A403V | R68S | 100/98 | ]]> 291 | No tto. | Benigna |
| R243X | V388M | 1/43 | 1 500 | No tto. | Clásico |
| R261Q | ]]> R408W | 27/2,7 | 1 200 | 588,3 | Clásico |
| R408W | R68S | 2,7/98 | 2100 | 355,2 | ]]> Clásico |
ND: No hay datos; ARP: Actividad residual predicha de la enzima in vitro; No tto.: No tratamiento
Se encontró un porcentaje de coincidencia del genotipo y el fenotipo del 78,8 %, lo que coincide con estudios realizados por otros autores. Ello pone en evidencia que existen otros factores que intervienen en la expresión fenotípica de la mutación.
En los hiperfenilalaninémicos homocigóticos se puede deducir el fenotipo resultante de acuerdo a la severidad de las mutaciones, las cuales han sido descritas con anterioridad. La mutación R176X no ha sido expresada in vitro, pero podemos predecir que producirá una proteína con alguna actividad, ya que el paciente presenta un fenotipo bioquímico intermedio. En los heterocigóticos se puede deducir, en muchos casos, el efecto de una mutación. Por ejemplo, la mutación F39L debe de ser nula o intermedia, ya que en combinación con otra mutación conocida por su actividad casi nula el fenotipo que se observa es clásico, mientras que la S349P debe ser nula, pues en combinación con otra intermedia, el fenotipo se comporta como clásico. Aunque se sabe que existen inconsistencias en cuanto a determinadas mutaciones que en ocasiones no tienen el mismo comportamiento y al parecer hay que tener en cuenta las interacciones entre subunidades que pueden influir en las manifestaciones fenotípicas.7
Se puede observar que los parámetros bioquímicos de los enfermos a quienes se les determinó el genotipo no coinciden en algunos casos con lo esperado. De acuerdo con las mutaciones encontradas, como la E280K, está reportado que en homocigosis debe dar un fenotipo clásico y en dos de ellos se comporta como un fenotipo intermedio. No ocurre así en el paciente con esta misma mutación, donde el fenotipo bioquímico coincide con el genotipo y la tolerancia a la fenilalanina. Cuando analizamos los niveles de tolerancia de acuerdo al fenotipo durante los primeros 5 años de vida, no hay suficiente correspondencia, pues realmente estos valores fueron transgredidos en muchos enfermos y se sabe la importancia de llevar una dieta correcta para mantener los niveles de fenilalanina en concentraciones terapéuticas.8,9
De esta manera se puede predecir el fenotipo bioquímico en la mayoría de los casos (78,2 %): según la combinación de mutaciones estudiada en cada caso y la base de datos del gen de la fenilalanina hidroxilasa de forma similar a como se realiza en otros laboratorios.8,9
Por lo general según la base de datos del gen de la fenilalanina hidroxilasa, la combinación de dos mutaciones severas resulta siempre en fenotipo clásico, dos mutaciones intermedias producen un fenotipo intermedio, y la presencia de una mutación de hiperfenilalaninemia resulta siempre en un fenotipo benigno; por lo que en estos casos se pueden distinguir los pacientes que van a recibir tratamiento dietético y los que no.
Cuando se combinan una mutación severa y una intermedia el resultado debería ser un fenotipo clásico, pero en la población cubana existen inconsistencias en esta relación, como con la mutación R261Q o la V388M que en combinación con mutaciones nulas produce fenotipos clásicos o atípicos. Estos resultados han sido descritos en otras poblaciones para las mutaciones (I65T y R261Q) así como (V388M, Y414C, R158Q).10,11 Todas ellas tienen en común que, al expresarlas in vitro, muestran proteína mutante inmunorreactiva.
]]> Existen cada vez más evidencias que apoyan la hipótesis de que la estabilidad de las proteínas mutantes puede variar, en función de las condiciones celulares y otros factores externos, lo cual puede modular también su actividad residual.12-15En conclusión, podemos decir que aunque la fenilcetonuria puede considerarse como un rasgo complejo, las mutaciones en el gen de fenilalanina hidroxilasa son el determinante principal del fenotipo metabólico en estos pacientes y hay que señalar que un acercamiento multidisciplinario es la mejor vía para la comprensión y el control individual.
CORRELATION BETWEEN THE GENOTYPE AND THE BIOCHEMICAL PHENOTYPE IN CUBAN PATIENTS WIHT HYPERPHENYLALANINEMIAS
Phenylketonuria is a recessive autosomal disease caused by mutations in the gene of the phenylalanine hydroxylase enzime. It has a wide phenotypic spectrum that depends mainly on the residual activity of the enzyme. Objectives: To detemine the genotype-chemical phenotype correlation in patients whose genotype is known, according to the residual activity of the mutated enzime expressed in vitro in accordance with the gene's database (http://www.mcgillca/pah/db). Methods: We evaluated the biochemical and molecular data of 23 hyperphenylalaninemic individuals. The concentration of phenylalanine at birth and the tolerance to phenylalanine at 5 years of the beginning of the treatment, as well as the residual activity in vitro of each of the mutations, were taken into account. Results and conclusions: According to the data base of the PAH gene and of the above parameters, 12 patients had severe mutations, 10 intermediate and 1 benign. Our study showed that there is a genotype-biochemical phenotype coincidence in 78.2 % of the subjects with phenylketonuria that were studied.It was proved that mutations in the PAH gene are the main factor in the determination of the metabolic phenotype in patients with hyperphenylalaninemia.
Key words: Hyperphenylalaninemia, phenylketonuria, genotype, phenotype, phenylalanine hydroxylase.
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Recibido: 10 de noviembre de 2004. Aprobado: 15 de enero de 2005.
Lic. Reinaldo Gutiérrez. Centro de Investigaciones Biomédicas. Instituto de Ciencias Médicas de La Habana. Ave. 31 No. 3 102, esquina a 146, Playa. Ciudad de La Habana. C.P. 11600. ]]>
1 Licenciado. en Ciencias Farmacéuticas. Máster en Genética Médica.
2 Licenciado en Ciencias Biológicas. Investigador Auxiliar.
3 Doctora en Ciencias Biológicas. Profesora Titular.
4 Especialista de I Grado en Pediatría. Máster en Nutrición.