CLONAJE BIOLÓGICO DE UN AISLADO DE CORONAVIRUS BOVINO
BIOLOGICAL CLONING OF A BOVINE CORONAVIRUS ISOLATE
A. Betancourt*, Edisleidy Rodríguez**, Damarys Relova** y Maritza Barrera**
*Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad Agraria de la Habana (UNAH), San José de las Lajas, La Habana, Cuba; **Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA), Apartado 10, San José de las Lajas, La Habana, Cuba. Correo electrónico: alex@isch.edu.cu ]]>
RESUMEN
Con el objetivo de obtener un aislado de Coronavirus bovino clonado biológicamente se adaptó el aislado VB73/04 a la multiplicación en la línea celular MDBK. Este aislado indujo la formación de placas, las cuales resultaron homogéneas después del clonaje biológico. La población viral obtenida fue identificada como Coronavirus bovino por RT-PCR y Seroneutralización.
Palabras clave: coronavirus bovino; clonaje biológico; disentería de invierno
ABSTRACT
In order to obtain a biologically cloned bovine coronavirus isolate, the isolate VB73/04 was adapted to multiplication in MDBK cell line. This isolate induced the formation of plaques, which were homogeneous after biological cloning. The viral population obtained was tested for bovine coronavirus by RT-PCR assay and seroneutralization.
Key words: bovine coronavirus; biological cloning; winter dysentery
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INTRODUCCION
Coronavirus bovino (BCoV) es reconocido como un importante agente patógeno del ganado bovino, el cual está asociado a trastornos neuma-entéricos (1,2,3,4,5,6).
En Cuba, después de diagnosticado BCoV como agente etiológico disentería de invierno (7,8,9), era necesario obtener una cepa autóctona para su empleo como antígeno, en las pruebas de detección de anticuerpos, como control positivo en las de detección de virus, y en futuras investigaciones relacionadas con el desarrollo de vacunas, evaluación de compuestos con actividad antiviral, e investigaciones básicas acerca de la evolución filogenética de este virus y su adaptación a las condiciones climáticas.
Diferentes autores han logrado la adaptación de BCoV a la multiplicación en líneas celulares (10) y la homogenización de poblaciones virales aisladas de campo mediante el clonaje biológico, lo que permite la posterior caracterización de estas cepas (11,12).
En correspondencia con lo anteriormente planteado, nos propusimos obtener un aislado de Coronavirus bovino clonado biológicamente, adaptado a la multiplicación en la línea celular MDBK.
MATERIALES Y MÉTODOS
Para la obtención de la cepa de BCoV se realizó el clonaje biológico del aislado VB73/04, tercer pase en CPRT (cultivo primario de riñón de ternero), recuperado a partir de una mezcla de heces fecales, procedentes de vacas con disentería de invierno (13). La línea celular empleada para el clonaje fue MDBK (Madin-Darby Bovine Kidney Cells), crecidas en placas de poliestireno de 35mm (Nunc).
Adaptación de BCoV a la multiplicación en MDBK: Las monocapas de células MDBK se inocularon con 200 µL de suspensión viral en diluciones de base 10 del aislado VB73/04 tercer pase en CPRT y 300 µL de medio de cultivo DMEM (Medio Mínimo de Eagle modificado por Dulbeco) Sigma-Aldrich Suiza, suplementado para aislamiento viral con antibiótico 5X [penicilina (500 000 U/mL) estreptomicina (0.5g/mL) y fungizona (5mg/mL)] y Tripsina 0.125%. Se dejaron placas como control de células, a las cuales se les adicionó 500 µL de medio de cultivo para aislamiento viral. Después de una hora de incubación a 37oC en atmósfera húmeda de CO2 5%, se les retiró el inóculo y se lavó con PBS (solución salina tamponada con fosfato pH 7.2) y posteriormente se adicionó a cada placa 1 mL de DMEM para aislamiento viral. Las placas se incubaron a 37oC en atmósfera húmeda de CO2 5%, con observación diaria al microscopio invertido. Finalmente, se realizaron ocho pases del aislado VB73/04 en la línea MDBK, se cosecharon las suspensiones virales y se titularon por el método de punto final de dilución, para lo que se realizaron diluciones seriadas base 10. Para el cálculo de las DICT50 se empleó el método de Reed y Muench (14). ]]>
Ensayo de placa: Se emplearon monocapas de la línea celular MDBK, crecidas en placas de poliestireno de 35 mm (Nunc), las cuales se inocularon con el aislado VB73/04, quinto pase en MDBK. Se utilizó el método descrito por Vautherot, (15) con algunas modificaciones que describimos brevemente: cada pozo se inoculó con 500 µL del virus en diluciones de base 10, desde 10-1 hasta 10-8 realizadas en medio de cultivo DMEM, para aislamiento viral, además se adicionó suero fetal bovino al 2%, Cansera, Canadá. Se dejaron cuatro pozos utilizados como control de células sin inocular, a los cuales se les adicionó 500 µL de medio de cultivo para aislamiento viral. Después de una hora de incubación a 37oC en atmósfera de CO2 5%, se retiró el inóculo y se adicionó 2 mL de DMEM para aislamiento viral, mezclado volumen a volumen con agarosa de bajo punto de fusión al 2% a una temperatura de 42oC. Finalmente, las placas se mantuvieron en la incubadora a 37oC en atmósfera húmeda de CO2 5% durante 48 horas.Tinción de las placas: A las 48 horas de la inoculación se tiñeron las placas inducidas por el virus con colorante rojo neutro, diluido 1:100 en DMEM para aislamiento viral; de esta dilución se aplicaron 2 mL a cada pozo y se protegieron de la luz con papel de aluminio, las que permanecieron en la incubadora a 37oC en atmósfera húmeda de CO2 5% durante 3 horas. A partir de aquí se seleccionaron las placas inducidas por el virus, para lo que se utilizaron pipetas Pasteur, las que se conservaron en 200 µL de DMEM para aislamiento viral y suero fetal bovino al 2%. Para realizar el segundo pase se seleccionó una de las placas inducidas por el virus, obtenidas en el primer pase y se realizó similar procedimiento otras dos veces.
Caracterización de las placas: Se caracterizaron las placas formadas por el virus, según el procedimiento descrito, con la diferencia que el colorante empleado fue cristal violeta. A las 48, 72 y 96 horas de la inoculación las monocapas se fijaron con formol al 10% en PBS por una hora, posteriormente se le retiró el agar y se tiñó con cristal violeta al 1% por 10 minutos, momento en el que se retiró el exceso de colorante y se procedió al conteo y medición de 100 placas al azar.
Confirmación del clon de BCoV: La confirmación de la población viral obtenida por la estrategia de clonaje biológico se realizó por RT-PCR (reverso transcriptasa acoplada a la reacción en cadena de la polimerasa), según describe Tsunemitsu et al. (16) y por seroneutralización (13) con suero hiperinmune específico (manuscrito en preparación).
Determinación de la m.o.i. (multiplicidad óptima de infección): Para el cálculo de la m.o.i. se emplearon placas de 35 mm de poliestireno sembradas con la línea celular MDBK crecidas en monocapas, las cuales fueron inoculadas con diferentes multiplicidad [5, 2, 1, 0.1, 0.01, 0.001 y 0.0001 (DICT50/célula)]. Se realizaron tres réplicas de cada m.o.i. Posteriormente se cosecharon y titularon todas las réplicas por el método de Reed y Muench (14).
Obtención de una semilla y un banco de trabajo: Para la obtención de una semilla de la cepa se realizaron tres pases, hasta obtener un banco de trabajo de 100 alícuotas, como se describe a continuación. Se inoculó un frasco ROUX, sembrado con la línea celular MDBK cuando la monocapa era confluente. Se retiró el medio de cultivo y se lavó con PBS, posteriormente se le retiró el PBS y se adicionó el inóculo, con un volumen de 10 mL de la suspensión viral, diluida en medio de cultivo DMEM, para aislamiento viral. Después de una hora de incubación a 37oC se le adicionaron 90 mL de DMEM para aislamiento viral. Finalmente, el cultivo se mantuvo en incubación a 37oC con observación diaria al microscopio invertido hasta que el ECP alcanzó entre el 80-90%. Para calcular el título viral se hicieron diluciones seriadas base 10 de la suspensión viral y se determinó el título infectivo por el método de Reed y Muench (14).
Análisis estadístico de los datos: Para determinar el valor promedio del diámetro de las placas que produce la cepa viral obtenida, se calculó la media, la desviación estándar y el coeficiente de variación, con un nivel de confianza del 99%, según el programa Microsoft Excel. Para comparar los títulos infectivos producidos en MDBK después de pasar la cepa con las diferentes multiplicidades de infección, se empleó la prueba no paramétrica Kruskal-Wallis, según el paquete estadístico SAS, 2001.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En el proceso de adaptación a la multiplicación en la línea celular MDBK, el aislado VB73/04 reveló bajos títulos infectivos en los primeros cuatro pases (Figura 1), sin embargo, los pases subsiguientes permitieron lograr un incremento del título infectivo a partir del quinto pase y hasta el octavo. ]]>
En los pases iniciales el efecto citopático (ECP) en las primeras 48 horas post-inoculación (PI) se caracterizó por la presentación de células alargadas, granulación celular y células redondeadas. A partir de las 48 horas PI se incrementó este efecto, y se observó un mayor número de células redondeadas y la presencia de células multinucleadas. Estas células sincitiales contenían aproximadamente 10 núcleos, aunque lo más común fue observar entre 4-6 núcleos por células y retracción de la monocapa alrededor de las 72 horas PI, momento en el que también se apreció desprendimiento celular con destrucción de la monocapa (Figura 2).
Las células utilizadas como controles permanecieron sin alteraciones ostensibles durante el tiempo de observación, por lo que las alteraciones descritas en los inoculados se atribuyeron a la presencia del virus.
Benfield y Saif (17) al estudiar la sensibilidad de diferentes líneas celulares a la multiplicación de BCoV no lograron el aislamiento primario del virus en MDBK, a diferencia del reporte de Dea et al. (18) y Saif et al. (19) quienes demostraron la susceptibilidad de estas células para lograr el aislamiento primario del virus. Por su parte, Yoo y Deregt (20) y Yoo y Pei (21), reportaron la permisividad de la línea celular MDBK para la propagación de la cepa Québec de BCoV.
La observación de pocas alteraciones celulares en las primeras 48 horas PI, parece estar relacionada con la concentración viral del inóculo, ya que a partir del quinto pase se evidenció un aumento del título infectivo (Figura 1), el cual se mantuvo en los pases subsiguientes. Los títulos infectivos más elevados se obtuvieron después de cinco pases; similar comportamiento ocurrió con relación a la dinámica del ECP, el cual a partir del quinto pase se completaba en 48 horas. Jerez et al. (6) encontraron un comportamiento semejante cuando se propusieron adaptar diferentes cepas de este virus a una línea celular de origen de pulmón de hámster.
Este resultado es expresión de la adaptación del virus al multiplicarse en esta línea celular, hecho de gran importancia, pues demostró la posibilidad de obtener una población viral adaptada, con estabilidad en el título infectivo.
Clonaje biológico del aislado
El aislado VB73/04 indujo la formación de placas a partir de las 48 horas PI (Figura 3). En este tiempo estas aparecieron como áreas redondas opalescentes con bordes bien delimitados al observarlas por iluminación indirecta con un transiluminador de luz blanca y la presencia de áreas de ECP examinado al microscopio invertido. Después de la tinción con rojo neutro o cristal violeta, las placas se observaron como áreas claras, ausentes de color y un diámetro promedio de 0.9 mm a los dos días PI, 1.5 mm después del tercer día PI, hasta alcanzar 2.5 mm al cuarto día PI. ]]>
El tiempo de aparición de las placas, así como las características morfológicas coincidió con lo reportado en la literatura por otros autores al inocular cepas de BCoV en diferentes líneas celulares (11,15,12). En las monocapas celulares empleadas como controles no se observó la formación de placas.La población viral obtenida resultó homogénea (Tabla 1), lo cual se correspondió con el clonaje, que era de esperarse, hasta alcanzar una población viral fenotípicamente homogénea para el diámetro de las placas, denominada cepa Guayabal.
Los resultados alcanzados relacionados con la obtención de una cepa de BCoV fenotípicamente homogénea, están en correspondencia con la estrategia de clonaje biológico, procedimiento empleado para cepas de BCoV que son adaptadas a multiplicarse en líneas celulares específicas, donde producen varios cambios citopatogénicos e inducen la formación de placas (19), propiedad utilizada en virología para la clonación de variantes genéticas individuales, lo que a su vez permite un aquilatamiento cualitativo de poblaciones virales que difieren en sus propiedades de multiplicación y citopatogénicas (15).
Las diferencias entre el diámetro de las placas inducida por BCoV han sido descritas, sin embargo, esto no se ha correlacionado en este virus con diferencias en cuanto a su patogenicidad. Storz et. al (12) reportaron que el aislado L9 de BCoV indujo la formación de placas con una talla promedio de 5 mm. Vautherot, (15) encontraron placas de 2 mm de diámetro con los aislados F15 y G110 de BCoV entre 2-3 días PI, similares a la inducidas por la cepa obtenida en esta investigación (Guayabal), con una talla promedio de 2.5 mm.
La identidad de la cepa Guayabal fue confirmada al amplificarse por RT-PCR un fragmento de la talla esperada, 407 pb, con el empleo de los cebadores específicos (16) diseñados a partir del gen que codifica la proteína de la nucleocápsida de BCoV.
En la suspensión viral analizada, la talla del fragmento amplificado coincidió con la de la cepa Kakegawa, utilizada como control positivo de la reacción (Figura 4).
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Además de la comprobación de la identidad de la cepa Guayabal por RT-PCR, esta cepa fue neutralizada por un antisuero policlonal contra una cepa de referencia de BCoV, cepa Kakegawa. El título infectivo en MDBK de la cepa fue 10 6.63 DICT50 con un índice de neutralización de 5.5.
Con todas las multiplicidades evaluadas se obtuvieron altos títulos infectivos (Figura 5), sin embargo, los mayores valores se corresponden con el empleo de una dosis infectiva por célula, la cual además mostró diferencias significativas con las restantes dosis infectivas evaluadas.
La cepa Guayabal mantuvo estabilidad en el título infectivo durante tres pases seriados, con valores de 109.5 DICT50 al emplear una dosis infectiva por célula; lo que ratifica su adaptación a la multiplicación en la línea celular MDBK. ]]>
A partir de la obtención de la cepa Guayabal se le dieron tres pases en MDBK y se conformó un banco de trabajo de 100 alícuotas, el cual se utilizará en el futuro como cepa de referencia de BCoV, para lo que se hace necesario realizar una caracterización física, química y biológica, con vista a su futuro empleo en la elaboración de medios diagnosticadores y como cepa de confrontación en experimentos para la evaluación de candidatos vacunales y/o antivirales.
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(Recibido 4-2-2008; Aceptado 6-8-2008) ]]>