REPRODUCCIÓN EXPERIMENTAL DE LA GASTROENTERITIS TRANSMISIBLE DEL CERDO
EXPERIMENTAL REPRODUCTION OF TRANSMISSIBLE GASTROENTERITIS
Edisleidy Rodríguez*, A. Betancourt**, J.A. Ancizar**, R. Joa**, A. López**, Damarys Relova* y Maritza Barrera*
*Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA), Apartado 10, San José de las Lajas, La Habana, Cuba. **Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad Agraria de la Habana (UNAH), San José de las Lajas, La Habana, Cuba; Correo electrónico: martell@isch.edu.cu
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RESUMEN
Se logró la reproducción experimental de la gastroenteritis transmisible del cerdo, luego de la inoculación por vía oral de un una cepa del virus aislado en Cuba. La aparición de las diarreas se produjo a partir de las 24 horas post-inoculación. En todos los cerdos inoculados se observaron en la necropsia, lesiones anatomo e histopatológicas compatibles con el cuadro descrito para esta enfermedad. A partir de la instauración de la diarrea hubo eliminación viral sin hallarse asociación de otro microorganismo patógeno; lo que demostró la enteropatogenicidad del aislado.
Palabras clave: gastroenteritis transmisible del cerdo; reproducción experimental; enteropatogenicidad
ABSTRACT
The experimental reproduction of transmissible gastroenteritis was achieved in newborn piglets, after inoculation by oral route of a strain of this virus isolated in Cuba. In both cases, diarrheas appeared at 24 hours post-inoculation. In all inoculated piglest, anatomo and histopathological lesions which corresponded to the disease were observed in necropsy. Transmissible gastroenteritis virus was excreted after the establishment of diarrhea and not any other pathogenic microorganism involved was found. This sustained the enteropathogenicity of the isolate.
Key words: transmissible gastroenteritis of pigs; experimental reproduction; enteropathogenicity
]]> INTRODUCCIÓN
La gastroenteritis transmisible del cerdo (TGE) es producida por un virus de la familia Coronaviridae, género Coronavirus (1), que se caracteriza por la presentación de diarreas profusas y vómitos; afecta todas las categorías porcinas (2), aunque se ha descrito que las crías son las más sensibles (3), donde se producen las mayores afectaciones económicas debido a su elevada morbilidad y letalidad, alcanzando valores de hasta un 100% (4).
Según los reportes registrados por la Organización Mundial de la Salud Animal (OMS), se han producido brotes epizoóticos de TGE en muchos países de Europa (continente que ha presentado la mayor incidencia del virus), Las Américas (Norte, Sur y Central), Asia (incluyendo a China, Japón y Corea), el sureste de Asia y partes del oeste de África (5, 2).
La presencia de TGE en Cuba ha sido confirmada en una alta proporción de cerdos y se ha observado que su asociación con la diarrea es altamente significativa (6). Sin embargo, para confirmar la patogenicidad de una cepa aislada de campo se hace necesario reproducir experimentalmente la enfermedad en condiciones controladas.
Sobre estas bases se hace necesario determinar la enteropatogenicidad de una cepa del virus de la TGE aislada en Cuba. Con este objetivo en el presente trabajo se realiza la reproducción experimental del cuadro diarreico de la TGE en cerdos inoculados con el virus aislado en cultivo de tejido.
MATERIALES Y MÉTODOS
Diseño de la reproducción experimental: Se emplearon seis crías de un día de edad, las cuales fueron divididas en dos grupos seleccionados al azar, un grupo inoculado (cuatro animales) y un grupo control negativo (dos animales).
A todos los animales se les tomaron muestras de sangre y exudados rectales antes de la inoculación con el objetivo de evaluar la presencia de anticuerpos maternos contra el virus de TGE a través de un ELISA comercial (Ingezim Corona Diferencial) y evaluar la presencia de virus en los animales antes de ser inoculados. A cada cerdo del grupo inoculado, se le administró 3 mL del aislado VB 266/03, primer pase en la línea celular ST (después de tres pases en riñón de cerdo (RCe), con un título infectivo de 108.1 DICT50/ml. Este virus fue aislado a partir de las heces fecales diarreicas (48 horas post inoculación (PI), tomadas de las crías enfermas de la reproducción experimental (6). A los animales del grupo control se les administraron por vía oral 3 mL de medio de cultivo estéril por animal, a través de una cánula esofágica estéril.
Control clínico: Todos los animales fueron controlados clínicamente hasta la fase final de la enfermedad, con una frecuencia de cada seis horas. Se observaron los siguientes aspectos: estado general, apetito, temperatura corporal y características de las heces fecales, observando la consistencia, cantidad, color y olor.
]]> Recuperación viral: Para el control de la eliminación de TGEv, se tomaron muestras de exudados rectales con una frecuencia de cada seis horas hasta el final del experimento. La identificación del virus se realizó por aislamiento viral en RCe y su posterior identificación a través de un ensayo de RT-nested PCR según el procedimiento descrito por Batista et al. (7).Control patomorfológico: Se realizó el sacrificio de los animales por insensibilización con cloroformo y desangrado por punción de la vena yugular. En todos los casos se realizó la descripción macroscópica externa y de órganos internos.
Para el estudio histopatológico se tomaron fragmentos de estómago, duodeno, yeyuno, íleon, ciego, colon y recto, con ganglios linfáticos mesentéricos, seleccionados al hacer la necropsia, y se conservó cada fragmento en formol al 10% en proporción 1:10 y procesados posteriormente por la técnica de inclusión en parafina y coloreadas con hematoxilina y eosina; además se tomaron muestras de duodeno, yeyuno e ileon para el aislamiento viral.
Exámenes complementarios: A partir de las muestras obtenidas por hisopaje rectal, se realizaron siembras bacteriológicas en los medios: Agar Sangre y Mc Conkey con el objetivo de identificar la presencia de bacterias enteropatógenas involucradas en el proceso diarreico. La siembra se realizó por estrías y las placas se incubaron a 37ºC en condiciones de aerobiosis durante 24 horas. La observación de las colonias se realizó a simple vista y se identificaron según los criterios descritos por Orskov (8) a través de la tinción de GRAM, la prueba de oxidasa (Sticks Oxidase, OXOID) y las pruebas bioquímicas para enterobacterias (API 20 E, bioMérieux, Francia).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Se logró reproducir la enfermedad clínica en cerdos de un día de edad, inoculados con el aislado VB 266/03, obtenido a partir de la primera reproducción experimental.
Los primeros signos clínicos comenzaron a presentarse a partir de las 24 horas PI, consistentes en piloerección y aparición de las primeras diarreas amarillentas, con una consistencia pastosa, las cuales, posteriormente se transformaron en verdosas, muy líquidas y con mucha fetidez (Figura 1).
Se apreciaron otros signos clínicos como decaimiento, apatía, depresión, temblores musculares, postración y deshidratación producto de las severas pérdidas de líquido producidas a través de las diarreas. Se produjo la muerte en uno de los cerdos inoculados entre las 60 y 72 horas PI. Brenner et al. (9), describieron resultados similares al evaluar las manifestaciones clínicas de los brotes epidémicos de TGEv ocurridos por primera vez en Israel durante el año 2004.
Las manifestaciones clínicas observadas se corresponden con las descritas previamente por Kim et al. (10), al evaluar la patogenicidad de un aislado de TGEv obtenido en Estados Unidos en el año 1999. Estos autores inocularon el virus adaptado a cultivo celular y el homogenado de intestino original del cual se aisló el mismo y encontraron que en ambos casos los cerdos inoculados desarrollaron diarreas severas a partir de las 24 horas PI.
]]> Otros autores obtuvieron resultados similares a los nuestros, al realizar infecciones experimentales con TGEv en cerdos susceptibles, donde observaron la aparición de las primeras diarreas alrededor de las 24 horas PI (11 y 12).Morilla et al. (13), refieren que la infección producida por el virus de la gastroenteritis transmisible del cerdo, a pesar de ser un proceso infeccioso, no ocasiona fiebre en el animal enfermo. Esta característica se pudo corroborar durante el desarrollo de esta reproducción experimental. Como se muestra en la Figura 2, todos los animales incluidos en el experimento, inoculados y controles, se mostraron apiréticos.
Además se pudo observar la presencia de hipotermia en una de las crías inoculadas (I3) durante la fase
final de la enfermedad (Figura 2), signo que refieren otros autores en múltiples ocasiones debido a la hipoglicemia que se produce en los animales enfermos, como consecuencia del síndrome de mala absorción que ocasiona el virus en las vellosidades intestinales, lo cual conlleva a una reducción en la digestión de los alimentos, debido a la disminución o ausencia de enzimas como la lactasa, así como la reducción en la absorción de productos de la digestión (14, 15, 2).
Por otra parte Morilla et al. (13), plantearon que la severidad de las diarreas se debe además, al aumento que se produce de la actividad secretora, debido a que las células de las criptas no son afectadas por el virus. Estas células son secretoras y se dividen rápidamente para reemplazar a las células epiteliales afectadas en las vellosidades, provocando una hipersecreción intestinal.
Alteraciones Anatomopatológicas
En todos los animales inoculados, se encontró el estómago distendido por gases, con leche coagulada en su interior. El intestino delgado, en todos los casos, contenía un líquido amarillo espumoso y las paredes se mostraron traslúcidas, debido a la destrucción de las vellosidades de la mucosa; las áreas de mayor afectación coincidieron con yeyuno e íleon. Además se pudo apreciar enteritis catarral y congestión (Figura 3). Todas estas lesiones observadas en el tracto gastrointestinal de los cerdos inoculados se corresponden con las descritas por Fediaevsky (2).
Morrilla et al. (13), refieren que el aspecto translúcido que se observa en las paredes del intestino delgado, se debe a la atrofia severa que provoca el virus en las vellosidades intestinales.
Durante la necropsia se analizaron también los segmentos pertenecientes al intestino grueso (ciego, colon y recto), sin encontrar ninguna afectación en esta área. Los animales utilizados como controles negativos del experimento no mostraron lesiones en ninguno de los órganos del tracto gastrointestinal.
Al realizar un examen histopatológico de las diferentes secciones del tracto gastrointestinal de los cerdos inoculados en la reproducción experimental, se encontraron las afectaciones más severas en el intestino delgado, con predominio en los segmentos yeyuno e íleon, donde se pudo apreciar hiperemia, descamación de células epiteliales de la mucosa con atrofia marcada de las vellosidades, presencia de infiltrado inflamatorio con predominio de células mononucleares e hiperplasia de los nódulos linfoides (Figura 4). Estas alteraciones se encontraron generalizadas en todos los animales inoculados y se corresponden con las lesiones descritas para este virus (9).
Las lesiones en duodeno fueron menos frecuentes, ya que solo en uno de los animales inoculados, se observó descamación de células epiteliales de la mucosa en este segmento intestinal.
El estómago al igual que el duodeno, solo se vio afectado en solo un animal inoculado, mostrando descamación epitelial y erosión focal de la mucosa.
Los resultados obtenidos durante este experimento se complementan con las observaciones descritas por Kim et al. (10), quienes evaluaron la atrofia que se produce en las vellosidades de los tres segmentos del intestino delgado, encontrando que el yeyuno e íleon se corresponden con las áreas de mayor afectación por el virus.
Morilla et al. (13), describen que TGEv se multiplica en las células epiteliales de la última porción del duodeno y la totalidad del yeyuno e íleon. Estos autores refieren que el virus no infecta la primera porción del duodeno debido a la presencia de lipasas y otras substancias lipolíticas de la bilis, que pueden afectar la envoltura lipídica del mismo, lo que explica que en este segmento no se produzca atrofia de las vellosidades y la mayor afectación ocurra en los segmentos siguientes.
En los cerdos que se utilizaron como controles negativos del experimento, no se observaron alteraciones histopatológicas en ninguno de los tejidos evaluados del tracto gastrointestinal (Figura 5).
Recuperación viral
Los exudados rectales tomados cada seis horas se evaluaron por aislamiento viral y se logró recuperar el virus a partir de las 24 horas PI. No se pudo determinar el límite de tiempo de excreción viral post-infección, ya que en el momento de sacrificio, los animales aún se encontraban eliminando virus en las heces fecales. Estos resultados se corresponden con los obtenidos por Kim et al. (16) quienes detectaron la eliminación viral en exudados rectales entre los días 1-4 PI a través de la técnica de RT-PCR.
Los exudados analizados en el momento cero de la inoculación y a partir de los cerdos controles negativos durante el experimento no produjeron efecto citopático.
]]> Una vez logrado el re-aislamiento del virus en cultivos celulares, se identificó a través de la técnica de RT-PCR. Como se muestra en la Figura 6, en los cuatro aislados obtenidos de los animales inoculados se obtuvo la amplificación de un producto de 478 pb, que se corresponde con la talla esperada cuando se emplean los cebadores descritos por Paton y Lowings (17).Las muestras de suero tomadas a todos los animales en el momento cero de la inoculación, resultaron negativas al ser procesadas a través del ELISA (Ingezim Corona Diferencial), lo cual indica que los cerdos no presentaban anticuerpos maternos que pudieran neutralizar el virus inoculado e interferir en el desarrollo de la enfermedad de los animales experimentalmente infectados.
Exámenes Complementarios
En ambos medios se observó el crecimiento de escasas colonias medianas, de color gris en Agar Sangre y rosadas en Mc Conkey, típicas de Escherichia coli (8).
Al analizar las colonias por medio de la tinción de Gram se observaron cocobacilos Gram negativos y la prueba de oxidasa resultó negativa, por lo que se aplicaron las pruebas bioquímicas (API 20 E bioMérieux) para enterobacterias. Por medio de este ensayo se obtuvieron resultados positivos con el número de referencia 7144512, correspondiente a la especie Escherichia coli I (18).
Dado el escaso crecimiento de las colonias, podemos inferir que la enterobacteria encontrada se corresponde con el crecimiento de una flora normal intestinal y que no hubo bacterias enteropatógenas involucradas en el proceso diarreico observado durante la reproducción experimental.
La reproducción experimental de la gastroenteritis transmisible del cerdo demostró la enteropatogenicidad de una cepa del virus aislada en Cuba. Estos resultados abren las puertas a futuras investigaciones encaminadas a la implementación de programas de control sobre la base del desarrollo de medios de diagnóstico y la generación de candidatos vacunales y antivirales, para los cuales se hace necesario contar con una cepa autóctona, enteropatógena, para su empleo en futuros ensayos de confrontación.
REFERENCIAS
1. Fauquet CM, Mayo MA, Maniloff J, Desselberger U, Ball LA. Virus Taxonomy, VIIIth Report of the ICTV 2005. Elsevier, Academic Press.
2. Fediaevsky A. 2004. B254 Transmissible Gastroenteritis. Manual for the recognition of exotic diseases of livestock. Disponible en: http://www.spc.int/rahs/Manual/Porcine/TGEE.htm [Consultada: 25 de junio de 2007].
3. Keenliside J. Transmissible Gastroenteritis (TGE) in Alberta. Bacon Bits. 2003;17(5).
4. Sestak K, Saif LJ. Porcine coronavirus. In Trends in emerging viral infection of swine. Iowa State Press, Ames 2002. pp 321-330.
5. United State Department of Agriculture (USDA) 1997. Swine 95 study. Part III: 1990-1995 changes in the US pork industry. 555 South Howes, Fort Collins, CO 80521.
6. Urquiaga R, Frías María Teresa, González S, Acevedo Ana María, Barrera Maritza, Díaz De Arce Heidy, Cuello Sandra, Sánchez G, Encinosa Adela, Ancheta Odelsa, Tablada Lydia M, Serrano E. Transmisible gastroenteritis. Reporte de la enfermedad en Cuba 2004. Rev Salud Anim. 2004;26(3):206-208.
7. Rodríguez Edisleidy, Betancourt A, Barrera Maritza, Changee Lee, Dongwan Yoo. Rapid detection of swine transmissible gastroenteritis virus by nested polymerase chain reaction. Rev Salud Anim. 2008;30(2):133-136.
8. Orskov F. Genus I. Escherichia Castellani and Chalmers 1919, 941. En: Krieg, N.R. y Holt, J.G. (Eds). BERGEY'S Manual of Systematic Bacteriology 1984. Volume I. Baltimore, USA. pp. 420-422.
9. Brenner J, Yadin H, Lavi J, Perl S, Edery N, Elad D, Bargut A, Pozzi S, Lavazza A, Cordioli P. Investigation of the first transmissible gastroenteretis (TGE) epidemic in pigs in Israel. Israel Veterinary Medical Association. 2004;59(3).
10.Kim L, Hayes J, Lewis P, Parwani AV, Chang KO, Saif LJ. Molecular characterization and pathogenesis of transmissible gastroenteritis coronavirus (TGEV) and porcine respiratory coronavirus (PRCV) field isolates co-circulating in a swine herd. Arch Virol. 2000;145:1133-1147.
11.Kim B, Chae C. Experimental Infection of Piglets with Transmissible Gastroenteritis Virus, a Comparison of Three Strains (Korean, Purdue and Miller). J Comp Path. 2002;126:30-37.
12.Rodák L, Smíd B, Nevoránková Z, Valícek L, Smítalova R. Use of Monoclonal Antibodies in Blocking ELISA Detection of Transmissible Gastroenteritis Virus in faeces of piglets. J Vet Med. 2005;52:105-111.
13.Morilla A, Jáuregui PH, Estrada A. Gastroenteritis transmisible de los cerdos. Ciencia Veterinaria. 1981;3:1-54.
14.Taylor DJ. Transmissible Gastroenteritis (T.G.E). En: Pig Diseases 1995. 6th edition. St Edmundsburry Press. pp- 31-36.
15.Murphy FA, Gibbs EP, Horzinek M, Studdert MJ. Veterinary Virology. Coronaviridae 1999. Third Edition, Academic Press. 501-502.
16.Kim L, Chang KO, Sestak K, Parwani A, Saif LJ. Development of a reverse transcription-nested polymerase chain reaction assay for differential diagnosis of transmissible gastroenteritis virus and porcine respiratory coronavirus from feces and nasal swabs of infected pigs. J Vet Diagn Invest. 2000;12(4):385-8.
17.Paton D, Lowings P. Discrimination between transmissible gastroenteritis virus isolates. Archives of Virology. 1997;142: 1703-1711.
18.API 20 E. Catalogue Analytique 1993. 3e édition. Copyright Bio Mérieux S.A. ISBN Nº 2-908684-18-7. France.
(Recibido 10-5-2008; Aceptado 2-9-2008)
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