RESUMEN

Staphylococcus aureus es un contaminante importante y frecuente de la leche. Actualmente los estudios de tipificación genética arrojan datos importantes para el control de su diseminación; los que se basan en la variabilidad genética de la especie bacteriana. Con el objetivo de detectar polimorfismo genético se aplicaron técnicas de tipificación basados en la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) de los genes coa y RNAr en aislamientos de S. aureus, a partir de leche de tanque de varias empresas de provincia La Habana y un caso de mastitis clínica. Por primera vez se comprobó la variabilidad genética de Staphylococcus aureus aislados en Cuba y se demostró la utilidad de las técnicas empleadas a nivel de zonas geográficas relativamente distantes y cercanas, con lo que se evidencia la distribución de ciertas variantes genéticas como aportes a la epidemiología molecular de este patógeno alimentario.

Palabras clave: Staphylococcus aureus; tipificación; variabilidad genética; leche

ABSTRACT

Staphylococcus aureus is an important and frequent contaminant of raw milk. At present the studies of genetic typing gives important data for controling their dissemination; those are based on genetic variability of the bacterial specie. With the goal of detecting genetic polymorphism typing techniques based on the Polymerase Chain Reaction (PCR) of the genes coa and RNAr were applied in S. aureus isolates from bulk and mastitic milk in Havana. The genetic variability of S. aureus isolates from bovine milk was proven for first time in Cuba and the usefulness of the techniques employed on relatively distant and near geographical areas was demonstrated, as well as the distribution of certain genetic variants as contribution to the molecular epidemiology of this food pathogen.

Key words: Staphylococcus aureus; typing; genetic variability; milk

Staphylococcus aureus es un patógeno versátil en animales y humanos. Puede causar enfermedades superficiales e internas, debido a la producción de exotoxinas y una variedad de síndromes toxémicos. La leche y productos lácteos han estado frecuentemente involucrados en brotes de enfermedades trasmitidas por alimentos (ETAs) contaminados con estafilococos, tanto como vehículo o lugar de multiplicación del patógeno. Entre las fuentes de contaminación bacteriana de la leche de tanque pue-den encontrarse las manos de los ordeñadores, los equipos de ordeño, el ambiente, la ubre y la piel del pezón de la vaca. Sin embargo, por las características epidemiológicas de S. aureus la fuente de infec-ción que más influye en su conteo final es la ubre del animal, lo que resalta la influencia de la mastitis bovina en la contaminación de la leche y productos lácteos (1).

Con el objetivo de conocer la variabilidad genética de S. aureus provenientes de leche de tanque se tomaron muestras en cinco vaquerías de dos Empresas Pecuarias y de un productor independiente (caso de mastitis clínica) de la provincia La Habana, así se formaron tres núcleos o zonas geográficamente dispersas entre sí dentro de la provincia; mientras que entre vaquerías de la misma empresa mantuvieron un vínculo geográfico y epidemiológico estrecho.

En total se colectaron diez muestras de leche cruda, nueve de tanque: 5 de la Empresa 1 y 4 de la Empresa 2 entre julio y octubre de 2008, mientras que la muestra restante se colectó de un caso de mastitis clínica en Marzo de 2009.

Cada muestra de leche se sembró en Agar Sangre, se aislaron las colonias sospechosas y se realizaron las pruebas: catalasa, Gram, glucosa anaerobia y coagulasa hasta llegar a la identificación bacteriana a nivel de especie (8). Luego de la extracción del ADN genómico a cada cepa según Guler et al. 2005, se empleó la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) para la tipificación genética de los aislados en estudio, utilizando los oligonucleótidos para el tipaje del gen coa: CCAG1 y CCAG2 (9) y el par de oligonucleótidos para la variabilidad intergénica del ARNr: RRNA1 y RRNA2 (10), de los mismos autores se siguieron los programas de amplificación. Se analizaron 7 µL de cada producto mediante electroforesis en gel de agarosa al 1.5%, teñido con bromuro de etidio y fotografiado. Cada ensayo de PCR se repitió tres veces. Durante la aplicación de las técnicas microbiológicas y moleculares se empleó la cepa de referencia de S. aureus ATCC 5638 como control positivo.

De las diez muestras analizadas se obtuvieron siete aislados de S. aureus, el 70% de muestras positivas coincide con los últimos informes sobre el aislamiento de patógenos de la mastitis en Cuba, donde S. aureus siempre resulta ser el de mayor prevalencia (2, 11).

Mediante el estudio de la variabilidad intergénica del RNAr o ribotipaje, se generaron de 5 a 6 bandas en el rango de 600 a 1100 pb aproximadamente (Figura 2). Basados en sus respectivos patrones de amplificación, los siete aislados de S. aureus pudieron ser clasificadas dentro de cuatro ribotipos, designados de R1 a R4 (Tabla 1), se observa el mismo patrón en las tres vaquerías de la Empresa 1, por lo que se puede verificar que el poder de discriminación es menor que la técnica anterior, a pesar de que no sucede lo mismo en la Empresa 2.