Germinación in vitro del polen de tabaco (Nicotiana tabacum L.)
In vitro germination of tobacco (Nicotiana tabacum L.) pollen
Javier Martínez-Pacheco
Departamento de Genética y Fitopatología, Instituto de Investigaciones del Tabaco, Carretera Tumbadero 8 ½ km, San Antonio de los Baños, Artemisa, Cuba, CP 38100.
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RESUMEN
Es importante conocer la viabilidad del polen de los genotipos de tabaco durante los programas de mejora. Los medios de cultivo para la germinación in vitro de polen permiten determinar la capacidad germinativa de los mismos en un corto período de tiempo. Para contribuir a este conocimiento se determinó la composición química de un medio de cultivo simple para la germinación in vitro de granos de polen de tabaco. Se evaluó la germinación in vitro del polen de genotipos de tabaco híbridos F1 "C-1", "C-2"; cultivares "Habana 2000", "Habana 92", "Corojo 99", "NC 1071" y la línea "Wz" en los medios de cultivo Brewbaker y Kwack (BK), SaCaBor(SCB), SaCaBorMag(SCBM) y SaCaBorMag-PEG(SCBMP), mediante un diseño experimental completamente aleatorizado con dos repeticiones. El análisis de varianza factorial univariante de los resultados mostró que los mayores porcentajes generales de germinación se lograron en el medio sólido SCB que contiene 150 mg L-1 de H3BO3, 400 mg L-1 de CaCl2 y 15 % de sacarosa. No se observó destrucción de los granos de polen o de los tubos polínicos por alteraciones del potencial osmótico en ninguno de los medios que se analizaron. La presencia de PEG-6000 en el medio SCBMP no tuvo un efecto significativo en la germinación con respecto al medio SCB o SCBM pero si en comparación con el medio BK. Se evidenció el efecto de los genotipos de tabaco y de la composición química de los medios de cultivo sobre la germinación in vitro de los granos de polen.
Palabras clave: boro, calcio, medio de cultivo, viabilidad.
ABSTRACT
Knowing the tobacco genotypes pollen viability during breeding programs is important. Culture media for in vitro pollen germination allows determining the germinative ability in a short period of time. To contribute to this knowledge, the chemical composition of a simple culture medium for in vitro germination of pollen grain was determined. The pollen grains in vitro germinations from seven tobacco genotypes: F1 hybrids "C-1", "C-2"; "Habana 2000" cv., "Habana 92" cv., "Corojo 99" cv., "NC 1071" cv. and the breeding line "Wz" were evaluated in the culture medium Brewbacker and Kwack (BK), SaCaBor(SCB), SaCaBorMag (SCBM) and SacaBorMag-PEG (SCBMP) through a random block experimental design with two replicates. The analysis of univariate factorial variance shows the highest general germination percentages were achieved in the solid medium SCB containing 150 mg L-1 H3BO3, 400 mg L-1 CaCl2 and 15 % sucrose. No pollen grain and pollen tube destruction in any medium due to osmotic potential alterations were observed. The presence of PEG-6000 in the medium SCBMP did not have any significant effect on the germination whether comparing with the SCB medium. The effect of the tobacco genotypes and the culture media chemical composition over the in vitro pollen germination was evidentiated.
Key words: boron, calcium, culture medium, viability.
INTRODUCCIÓN
]]> En los programas de mejora del tabaco (Nicotiana tabacum L.) en Cuba, es necesario conocer la viabilidad y capacidad germinativa del polen de los progenitores seleccionados durante las primeras etapas del programa. De esto depende la ocurrencia de eventos exitosos de polinización y por consiguiente la obtención de semillas híbridas viables para la producción de tabaco. De igualforma, es de suma importancia evaluar con antelación la germinación del polen del progenitor masculino en los programas de obtención de semillas de híbridos F1 comerciales de tabaco en el país. Así se garantiza la mayor producción de semillas de calidad durante la campaña tabacalera anual para evitar retrasos en el cronograma de siembra según la política varietal de tabaco establecida.
MATERIALES Y MÉTODOS
Material vegetal
Se seleccionaron 25 plantas de cinco genotipos de tabaco Negro, los cultivares comerciales cubanos: "Corojo-99" (C-99), "Habana-92" (H-92) y "Habana-2000" (H-2000) e híbridos F1: "C-1" y "C-2"; y dos de tabaco Virginia, la línea "Wz" (Wz) y el cultivar "NC 1071" (NC). Todas las plantas se encontraban libres de enfermedades y con presencia de inflorescencias prominentes en inicio de floración. Al momento de la colecta (8:00 am-9:00 am) se eligieron 80 flores de cada genotipo que no presentaran ninguna antera abierta. Estas flores se depositaron en frascos secos de cristal y trasladaron inmediatamente al laboratorio para monitorear la dehiscencia de las anteras y colectar el polen. Se emplearon pinceles de cerdas suaves para remover todo el contenido de las anteras y depositarlo en placas de Petri, que se almacenaron a 4 0C, en un lugar seco y fresco hasta su uso.
Germinación in vitro del polen
Se decidió evaluar la germinación de granos de polen de tabaco in vitro en cuatro medios de cultivo. Tres medios de cultivo desarrollados en el laboratorio de Genética del IIT sobre la base de la importancia de los iones Ca2+,B3+, Mg2+ y de la sacarosa en el desarrollo del tubo polínico, los medios sólidos: SaCaBor (SCB) y SaCaBorMag (SCBM) y el medio líquido SaCaBorMag-PEG 6000 (SCBMP). El medio de cultivo de Brewbaker y Kwack (BK) (1) desarrollado en 1963, del cual se conoce su capacidad para la germinación del polen de tabaco se tomó como Control. El pH de los medios de cultivo se ajustó a un valor de 5,52± 0,02 y sus composiciones químicas se muestra en la Tabla. Los medios se esterilizaron en autoclave a 121 0C por 15 minutos.
Los granos de polen se dispersaron en placas de Petri que contenían 0,01 L de los medios de cultivo, se taparon y se incubaron a la luz durante 20 horas/22 0C para maximizar el tiempo de exposición del polen a los componentes de los medios de cultivo. Se realizaron dos repeticiones por genotipo de tabaco para cada medio de germinación in vitro. Pasado este tiempo se evaluó la germinación de 200 ±2 granos de polen que se seleccionaron aleatoriamente, con un microscopio invertido (Zeiss, Alemania), en diferentes campos de observación. El porcentaje de germinación se calculó como:
Germinación (%)= granos de polen germinados / total de granos seleccionados
Se consideró como grano de polen germinado aquel cuyo tubo polínico resultó dos veces mayor que el diámetro del grano de polen (6).
Análisis estadístico
El estudio de la germinación in vitro se llevo a cabo mediante un diseño experimental completamente aleatorizado con dos repeticiones por medio de cultivo.Se realizaron las pruebas de Kolmogorov-Smirnov y Shapiro-Wilk para comprobar el ajuste de los datos a una distribución normal. Los datos se sometieron a un análisis de varianza factorial univariante. La comparación de las medias de los valores que se obtuvieron se realizó mediante la prueba de Kruskal-Wallis. Posteriormente, no asumiendo homogeneidad de varianzas se realizó la prueba post-hoc de Games-Howell. Para el análisis de los datos se empleó el programa IBM ® SPSS ® Statistics Version 19 (SPSS Inc.; EE.UU, 2010).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Los resultados de germinación in vitro de los granos de polen para cada medio de cultivo, así como para cada genotipo de tabaco que se evaluó mostraron una gran variación. La Figura 1 muestra los resultados. Un análisis general de la germinación hace evidente que los tres medios de cultivo que se desarrollaron para este estudio permitieron la germinación in vitro del polen en la mayor cantidad de genotipos si se compara con el medio de cultivo BK.
El mayor porcentaje de germinación para un medio se logró con el medio de cultivo SCB donde el híbrido "C-1" resultó ser el genotipo con la mayor germinación (43,50 %); sin embargo, el medio SCB no favoreció la germinación del polen de los cultivares "Habana-2000" y "Wz". Una posible explicación para la mayor germinación de algunos genotipos de tabaco en el medio SCB es que este medio de cultivo ofrece suficiente consistencia, concentración y suministro de minerales para algunos genotipos, no así para los genotipos "Habana-2000" y "Wz". Este medio de cultivo sólo contiene como elementos minerales al Ca2+ y B3+ y sacarosa como elemento nutritivo. Brewbacker y Kwack (1), demostraron la importancia del calcio en el proceso de desarrollo del tubo polínico in vitro al comprobar que la ausencia de este ion en el medio de cultivo inhibe por completo la germinación de los granos de polen de 86 especies de 39 familias diferentes, inluido el género Nicotiana.
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2+. Una inhibición de la germinación, así como de la elongación del tubo polínico se observa en concentraciones de Ca2+ menores de 10 mg L-1 y por encima de los 1000/ 10000 mg L-1 dependiendo de la especie (1,7). Se conoce que en el grano de polen la concentración citoplasmática de Ca2+ aumenta en el sitio potencial de germinación y permanece alta hasta la emergencia del tubo polínico (8,9). El calcio es capaz de unirse a las pectinas de las paredes del tubo polínico, evento que aumenta la rigidez de la pared celular y regula la permeabilidad de las células del polen y de esta forma se potencia el crecimiento del tubo polínico sin que se provoque una ruptura de la membrana (10).
El medio de cultivo SCB contiene la concentración más alta de H3BO3 (150 mg L-1) de los cuatro medios que se analizaron, por lo que aporta la mayor cantidad de iones B3+ para la germinación y posterior desarrollo del tubo polínico. El boro esta directamente involucrado en la síntesis de pectinas y ayuda en la síntesis de calosa (11), de esta forma se involucra de manera indirecta en el desarrollo de la membrana del tubo polínico durante su crecimiento. Se cree que el boro promueve la germinación del polen afectando la actividad de la H+-ATPasa que participa en el proceso (11,12). El medio de cultivo SCBM favoreció la germinación del cultivar "NC 1071" (41,50 %) y de la línea "Wz" (37 %), ambos genotipos de tabaco tipo Virginia. La presencia de Mg2+ en este medio de cultivo particular puede contribuir a potenciar la germinación de los genotipos de tabaco Virginia sobre el resto de los genotipos de tabaco Negro. Los requerimientos específicos para la germinación in vitro del polen, de sacarosa, Ca2+, B3+ o Mg2+ así como de otros iones, pueden variar entre los genotipos de tabaco evaluados, como se evidencia en los resultados.
Un medio de germinación de polen se puede considerar efectivo cuando se obtiene la máxima germinación y la mínima destrucción de los granos, por alguna alteración del potencial osmótico del medio, por ejemplo. En este trabajo, se puede considerar al medio SCB, como medio efectivo, aunque en los medios de cultivo BK, SCBM y SCBMP no ocurrió la destrucción de los granos, según observaciones al microscopio, el porcentaje de germinación general en estos no fue mayor que en el medio de cultivo SCB. Además, es posible que el medio de cultivo SCB proporcione condiciones de germinación similares a las condiciones in vivo de la germinación del grano de polen y del desarrollo y elongación del tubo polínico en flores de tabaco para la mayor parte de los genotipos que se evaluaron.
A pesar de que los medios BK, SCBM Y SCBMP aportan otros iones importantes como potasio, nitratos y magnesio, es evidente el papel esencial de los iones Ca2+ y B3+, así como la presencia de sacarosa como fuente de carbono en el medio de cultivo SCB. Los medios de cultivo analizados pueden no reflejar de manera exacta el ambiente que rodea al polen en el estigma durante el evento de la polinización; sin embargo, las concentraciones de los elementos nutritivos en el medio SCB que se requieren para estimular la germinación del polen, quizás sean similares o se acerquen a las concentraciones en las condiciones in vivo para la mayoria de los genotipos de tabaco que se evaluaron.
Un aspecto importante a analizar es la influencia del genotipo per se en la germinación in vitro de los granos de polen. No existen relaciones de parentesco entre el conjunto de genotipos, solo entre "C-1" y "C-2" y entre "Habana-2000" y "Corojo-99". Los genotipos "C-1" y "C-2" corresponden a híbridos F1 que se obtuvieron mediante un cruzamiento recíproco entre sus progenitores y se esperaría que sus porcentajes de germinación en un mismo medio de cultivo tuvieran valores similares. Sin embargo, el comportamiento de los híbridos en cuanto a la germinación no es uniforme, con diferencias significativas para los medios de cultivo SCB, SCBM y SCBMP. De forma general, las diferencias en la germinación del polen y en el crecimiento del tubo polínico que se encontraron en este estudio, pueden estar dadas por diferencias reales en el vigor intrínseco del polen entre los genotipos de tabaco, como consecuencia del origen genético diferente de cada genotipo . De forma particular, el alto grado de heterocigocidad de "C-1" y "C-2", un elemento característico de los híbridos F1, puede ser la causa posible de variación entre ambos genotipos.
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óptima de un 15 % para el SCB . La sacarosa (15 %) en combinación con el ácido bórico (150 mg L-1) en el medio de cultivo SCB mostró buenos resultados para la germinación. El boro puede crear un complejo con la sacarosa y este complejo borato-azúcar es capaz de translocarse a través de las membranas mejor que las moléculas de azúcares no ionizadas (11).
La presencia de Polietilenglicol-6000 (PEG-6000) en el medio SCBMP, en su función de regulador osmótico no metabolizado por el polen, perseguía el objetivo de evitar la destrucción de los granos de polen, evento muy común cuando existen alteraciones de los componentes del medio de germinación in vitro (14), además de comprobar si su incorporación al medio de cultivo potenciaba la germinación del polen de tabaco. Se determinó el potencial osmótico del medio con un valor aproximado de 800 mOsm, donde la concentración inicial de sacarosa tiene la mayor contribución al potencial osmótico (20 %, 584 mM) en relación con la concentración de PEG-6000 (12,5 %, 21 mM).
Se demostró que el PEG es efectivo en la germinación del polen y su adición al medio de cultivo se recomienda para diferentes géneros, como Brassica (15), Cicer (16) y Nicotiana (17). Los mayores porcentajes de germinación en este medio de cultivo se obtuvieron para el cultivar "NC 1071" (33 %) y el híbrido "C-2" (26,50 %) aún así estos fueron menores que sus valores equivalentes en el medio de cultivo SCB.
En ninguno de los medios de cultivo se observaron anormalidades morfológicas en los granos de polen, destrucción del tubo polínico o destrucción del ápice del tubo polínico (Figura 2), todos estos efectos son consecuencias de un choque osmótico por alteraciones o deficiencias en las concentraciones de los iones u otros componentes osmóticamente activos en el medio de cultivo (11,12). La deficiencia de B3+ reduce la extensibilidad plastica de la pared celular e impide la elongación celular normal en tejidos vegetales en crecimiento.También puede causar anormalidades morfológicas como la destrucción de los ápices del tubo polínico que puede aumentar el número de granos de polen que se destruyen con la consiguiente liberación del contenido citoplasmático al exterior y una disminución de la tasa de germinación (11,18).
Las concentraciones en todos los medios de cultivo se mantuvieron en niveles aceptables y permisibles para la germinación de los granos de polen y el desarrollo adecuado del tubo polínico.De todos los genotipos, el híbrido "C-1" mostró la mayor germinación del estudio (43, 50 %) en el medio SCB, con longitudes del tubo polínico (no se muestran), que superaron en cuatro veces la longitud del eje polar de los granos de polen del resto de los genotipos (Figura 2).
]]> CONCLUSIONES
Ninguno de los tres medios de cultivo que se desarrollaron permitieron la germinación uniforme de los genotipos de tabaco. El mayor porcentaje general de germinación media de los granos de polen se obtuvo en el medio de cultivo SCB (150 mg L-1 de H3BO3, 400 mg L-1 de CaCl2 y 15 % de sacarosa), solo para cinco de los genotipos. La germinación in vitro de los granos de polen es dependiente del vigor intrínseco del polen entre los genotipos de tabaco y de la composición química de los medios de cultivo.
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Recibido: 17/03/2017
Aceptado: 12/10/2017
Javier Martínez-Pacheco, Departamento de Genética y Fitopatología, Instituto de Investigaciones del Tabaco, Carretera Tumbadero 8 ½ km, San Antonio de los Baños, Artemisa, Cuba, CP 38100. Email: biologia1@iitabaco.co.cu
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