Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí"
Dr. PEDRO MAS LAGO,<1 Dr. ANGEL BALMASEDA,<2 Dra. IVONNE AVALOS,<3 Lic. AIDA CASTILLO,<4 Dra. MARIA G. GUZMAN,1 Dra. ALINA LLOP1 y Téc. ROSA PALOMERA<5
Se realizaron determinaciones de anticuerpos neutralizantes en sueros de pacientes con neuropatía epidémica y de grupos de personas aparentemente sanas, a la cepa 47/93 IPK (CA9) y la 590 productora de efecto citopático ligero (ECP-L), así como a las cepas de referencia de CA9 y CB1-6, por la técnica de microneutralización. Los enfermos y sus contactos mostraron porcentajes significativamente superiores de anticuerpos neutralizantes a la cepa 47/93 que el grupo considerado control y los residentes en municipios de baja tasa de la enfermedad. Esta diferencia también se comprobó en los títulos promedio geométrico (TPG) con las cepas de referencia de CA9 y CB2-4. Se comprobó un incremento de la circulación de la cepa 47/93 en la población infantil desde 1981 a 1993. Los enfermos mostraron porcentajes y TPG significativamente menores de anticuerpos neutralizantes a la cepa 590 que el grupo control, a pesar de que en 25/28 se habían aislado agentes con ECP-L. Se plantea la posibilidad de 2 mecanismos de neutralización y se formula una hipótesis sobre el mecanismo por el cual estos virus puedan participar en la fisiopatología de la enfermedad.
Palabras clave: NEURITIS/líquido cefalorraquídeo; NEURITIS/sangre; NEURITIS OPTICA/líquido cefalorraquídeo; NEURITIS OPTICA/sangre; VIRUS COXSACKIE A/aislamiento & purificación; CELULAS VERO; EFECTO CITOPATOGENICO VIRAL; TEST DE NEUTRALIZACION/métodos.
El diagnóstico serológico en las infecciones agudas por Enterovirus, al igual que por otros agentes virales, se establece al poner de manifiesto un incremento de 4 diluciones o más o 1 serocon versión en sueros pares obtenido el primero al inicio del cuadro clínico y el segundo 3 semanas después.1 En algunos casos se detectan títulos altos de anticuerpos en ambos sueros lo cual se explica por un período de incubación de la enfermedad más prolongado.1,2 En casos de infecciones subagudas o crónicas, como en las miocardiopatías dilatadas, la relación causal con los virus Coxsackie B se estableció por una mayor seroprevalencia en grupos de enfermos que en controles.3,4 En una epidemia de meningoencefalitis viral por CB5 en la población infantil, sólo en el 16,1 % se pudo demostrar incremento del título de anticuerpos en los sueros pareados.2 Durante la neuropatía epidémica que afectó a la población cubana desde finales de 1991 hasta los primeros meses de 1993, se aislaron en células Vero inoculadas con líquido cefalorraquídeo (LCR) de pacientes, 5 cepas de Enterovirus identificadas como Coxsackie A9 (CA9) y 100 de un agente productor de un efecto citopatogénico ligero (ECP-L).5,6 Con el fin de correlacionar estos aislamientos como posibles participantes en la causa de la epidemia se investi gó la presencia de anticuerpos neutralizantes en pacientes y diferentes grupos de personas supuesta mente sanas frente a 2 cepas seleccionadas y otros miembros del grugo Enterovirus. El objetivo del presente trabajo es dar a conocer los resultados obtenidos en estas investigaciones
Sueros. Se investigaron en total 738 sueros agrupados en la forma siguiente: 254 correspon dientes a pacientes ingresados en el Centro de Investigaciones Médico-Quirúrgicas (CIMEQ) con el criterio clínico de padecer neuropatía epidémica de la forma óptica y/o periférica, 43 de personas supuestamente sanas que convivían o trabajaban en contacto con enfermos de neuropatía (contactos), 73 de personas supuestamente sanas de un mismo centro laboral en la provincia Ciudad de La Habana (controles), 273 de personas supuestamente sanas residentes en municipios con baja tasa de la enfermedad y 95 sueros de niños, obtenidos en años anteriores (25 en 1981, 20 en 1989, 20 en 1990 y 30 en 1993) que padecían enfermedades distintas a infecciones del sistema nervioso central. Todas las muestras fueron conservadas a -20 ·C hasta el momento de ser trabajadas.
Determinación de anticuerpos neutralizantes. Se realizó por microneutralización según el método normado para la determinación de anticuerpos neutralizantes a Poliovirus,7 con las siguientes modificaciones: uso de células Vero, lectura microscópica del ECP, uso de medio Parker 199 con 2 % de suero de ternera fetal inactivado e inicio de las diluciones de los sueros en: 1:10.
Virus. Se utilizaron las cepas 47/93 IPK (CA9) y M28-CIGB (590) de ECP-L aisladas de LCR de pacientes con diagnóstico clínico de neuropatía epidémica. También fueron utilizadas las cepas de referencia de Coxsackie B1-6 (CB1-6) y CA9 obtenidas del Instituto de Poliomielitis y Virus de Encefalitis, Moscú, Rusia.
El porcentaje de sueros con anticuerpos neutralizantes en dilución igual o mayor 1:10 y los títulos promedio geométricos (TPG) a la cepa 47/93 IPK es significativamente superior (p < 0,05) en las personas enfermas que en los sueros obtenidos de personas sanas de un centro de trabajo de Ciudad de La Habana y los residentes en los municipios con baja tasa de la enfermedad. No existió diferencia en el porcentaje y TPG entre enfermos y contactos (tabla 1).
]]> Los TPG de anticuerpos neutralizantes fueron significativamente superiores (p < 0,01) al CA9, CB2 y CB4, la diferencia es menor al CB3 (p < 0,05) en los pacientes que en los controles (figura). La mayor diferencia de los TPG entre enfermos y controles corresponde al CB4 donde existe un incremento de más de 6 veces el título.El incremento del porcentaje de suero con anticuerpos neutralizantes en título mayor o igual a 1:10 a la cepa 47/93 se aumentó en la población infantil de 36 % en 1981 a 76,6 % en 1993, lo cual sugiere una circulación creciente de este virus u otro relacionado antigénicamente en esta población (tabla 2).
Lo difícil de observar y lo tardío de la aparición del ECP en las cepas que lo presentaban en la forma ECP-L hizo que el número de sueros investigados por neutralización a éstas fuera pequeño. No obstante, el porcentaje de suero con título igual o mayor 1:10 a la cepa 590 resultó mayor en los controles que en los enfermos (p < 0,05). Estos mismos sueros mostraron un porcentaje mayor en los enfermos que en los controles a la cepa 47/93 (p < 0,05) (tabla 3). También existe diferencia significativa (p < 0,05) cuando se comparan los tenores de anticuerpos en el grupo de enfermos a las cepas 590 (50 %) y 47/93 (92,8 %), y no existe diferencia entre ambas cepas en el grupo de sueros controles. También los TPG de anticuerpos neutralizantes muestran diferencias a las cepas investigadas cuando se comparan ambos grupos.
Los pacientes de neuropatía epidémica tenían un período de latencia de 2 o más meses con evolución subaguda,8 por lo cual a los efectos del diagnóstico serológico no se puede aplicar el criterio de aumento de anticuerpos en sueros pareados como en las infecciones virales agudas, para estos fines es más válido el estudio de la seroprevalencia en grupos de pacientes y controles.
El porcentaje significativamente superior de sueros con anticuerpos neutralizantes a los virus CA9 (cepa 47/93) en los grupos de enfermos y contactos que en los controles y habitantes de municipios de baja tasa de la enfermedad, debe interpretarse como resultado de una mayor circulación de agentes relacionados antigénicamente con estos virus o al menos que se han puesto en contacto con sus antígenos. Aboga en favor de esta interpretación el incremento del porcentaje de sueros con anticuerpos a la cepa 47/93 en la población infantil (reservorios naturales de estos virus), que se produce en la década inmediata anterior al inicio de la epidemia.
La gran diferencia en los TPG encontrada entre pacientes y controles a los virus CA9 y CB4 reafirma lo planteado anteriormente y se corresponde con la respuesta de anticuerpos en conejos inmunizados con los agentes de ECP-L, en los que se observó una respuesta de anticuerpo a los virus CA9 y CB4, y los cuales tuvieron un alto porcentaje de aislamiento en los enfermos.9 Por otro lado los TPG de la población enferma a los virus CA9 y CB4 son sólo ligeramente inferiores al encontrado al CB5 en sueros de fase convalesciente de niños con meningoencefalitis por este virus.4 Las diferencias en los TPG a los virus CB2 y CB3 pueden explicarse por una respuesta anamnésica a infecciones por estos virus en años anteriores, ya que los agentes de ECP-L no indujeron anticuerpos al CB2 y CB3 en los conejos inmunizados.
Resulta sorprendente que los porcentajes de anticuerpos neutralizantes a la cepa 590 sean significativamente inferiores en los enfermos que en los controles a pesar que en 25 de los 28 pacientes estudiados se aislaron agentes de este tipo y mucho más cuando se muestra en esos mismos pacientes el 92,8 % con anticuerpos a la cepa 47/93. Partiendo del hecho que los anticuerpos neutralizantes para ambos agentes no tienen diferencias en el grupo control, y que por inmunoblot no se pudo demostrar la presencia de anticuerpos a proteínas estructurales en las cepas de ECP-L,10 podría pensarse que la neutralización se está produciendo por acción de los anticuerpos en 2 proteínas: las estructurales y las "precursoras". De esta forma las cepas que muestran proteínas estructurales tendrían 2 vías de neutralización, mientras que las de ECP-L sólo serían neutralizadas por los anticuerpos para las proteínas "precursoras".
El porcentaje y el TPG significativamente inferiores de anticuerpos a la cepa 590 en los enfermos que en los controles podrían hipotética mente explicarse por un consumo interno de estos anticuerpos en pacientes que tienen una larga evolución. Se ha reportado que la secuencia nucleotídica de la zona P3A de algunos virus Coxsackie (CB3 y CB4) tiene una gran homología nucleotídica con la que codifica para la proteína básica de la mielina.11 Por otra parte, de pacientes con esclerosis lateral amiotrófica se han aislado inmunocomplejos que, inoculados en conejos, inducen la formación de anticuerpos que reaccionan por inmunofluorescencia y ELISA con células infectadas por virus CB4 y CA9 pero no con los viriones purificados, lo que ha permitido a los autores inferir que la reacción se produce por proteínas no estructurales inducidas en el ciclo de replicación de esos virus.12 Los resultados expuestos hacen que se valore, entre otros, un mecanismo inmunopatológico mediado por virus en la fisiopatología de la neuropatía epidémica. En conclusión, el perfil serológico de anticuerpos neutralizantes en pacientes con neuropatía se corresponde con las características antigénicas de los agentes aislados, se reafirma que estos agentes proceden de las muestras estudiadas y no son producto de virus latentes en los sistemas celulares utilizados o cualquier otra contaminación de laboratorio. Al mismo tiempo se convierte en un fuerte estímulo para investigar los mecanismos por los cuales, unidos a otros factores, estos virus intervienen en la fisiopatología de la enfermedad.
Queremos dejar constancia de nuestro agradecimiento a la UNESCO por haber financiado en parte esta investigación (Contrato No.883579.3).
<1Doctor en Ciencias Médicas. Especialista de II Grado en Microbiología. Investigador Titular.
]]> <2Especialista de I Grado en Microbiología.<3Residente de 2do. año en Microbiología.
<4Licenciada en Microbiología. Investigadora Agregada.
<5Técnica en Virología.
Recibido: 27 de octubre de 1994. Aprobado: 12 de diciembre de 1994.
Dr. Pedro Más Lago. Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí". Apartado 601, Marianao 13, Ciudad de La Habana, Cuba.
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