Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí"
Dra. MARIA G. GUZMAN,<1 Dra. SONIA RESIK,<2 Dr. CARLOS SARIOL,2 Lic. ROSMARI RODRIGUEZ,<3 Lic. MAYLING ALVAREZ,<4 Lic. LUIS MORIER,<5 Lic. AIDA CASTILLO,<6 Dr. GUSTAVO KOURI1 y Dr. PEDRO MAS1
En el presente estudio se demuestra la presencia de 2 agentes con características culturales diferentes, tanto de una cepa de Cox A9, como en una productora de efecto citopatogénico ligero (ECP-L), ambas aisladas de pacientes con neuropatía epidémica. Mediante neutralización del Cox A9 con su suero hiperinmune homólogo se desarrolló en la dilución 10-4 un ECP-L que se propagó en pases sucesivos. Se realizó un gradiente de sacarosa a una cepa productora de ECP-L, y de una de las fracciones pasada en cultivo de tejido en presencia de ácido fosfonoacético (PAA) se desarrolló un ECP típico de Enterovirus. Se discute el posible rol patogénico de éstos.
Palabras clave: NEURITIS/líquido cefalorraquídeo; ENTEROVIRUS/aislamiento & purificación; EFECTO CITOPATOGENICO VIRAL; CELULAS VERO; ALLIUM CEPA/aislamiento & purificación.
Durante un brote de neuropatía epidémica (NE) ocurrido en Cuba en los años 1991-1993 se aislaron varios Enterovirus y un agente productor de un efecto citopático ligero (ECP-L) de progresión lenta, en la mayoría de las muestras estudiadas de líquido cefalorraquídeo (LCR) de pacientes.1 Posteriormente, Ito et al. (comunicación personal) demostraron la presencia del virus de Inoue-Melnick en algunas de las muestras de las que se había aislado previamente el agente productor de ECP-L.
Durante el proceso de aislamiento viral efectuado en células Vero (ATCC) se puso de manifiesto en varias ocasiones la presencia de un ECP típico de Enterovirus en muestras de las que previamente se había aislado el agente productor de ECP-L. Además, mediante tratamiento de muestras de LCR a pH bajos con el objetivo de romper posibles inmunocomplejos (virus-anticuerpos), se aislaron 2 cepas de Enterovirus en muestras en las que anteriormente se había aislado el agente productor de ECP-L (Más et al. comunicación personal).
Al realizar los estudios de caracterización frente a varios agentes físicos y químicos de las cepas productoras de ECP-L, observamos un comportamiento intermedio y no concluyente en relación con los Enterovirus y con los virus Herpes (clasificación sugerida para el virus de Inoue-Melnick).2
Estos hallazgos, así como otros previamente reportados por Más et al.,3 en los que se demuestra comunidad antigénica entre cepas de Enterovirus y de ECP-L utilizando sueros hiperinmunes producidos a estas últimas, sugirieron la posibilidad de existencia en la misma muestra de 2 agentes o al menos de 2 variantes de un mismo virus.
Considerando los resultados previamente expuestos intentamos la purificación y caracterización del agente en cuestión.
Virus. Fueron estudiadas las cepas 47/93 IPK identificada como Cox A9 y la cepa M26 (aislada en el Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología y enviada posteriormente a nuestro laboratorio donde se acotó como 589/93 CIGB productora de ECP-L). Ambas fueron aisladas del LCR de pacientes con NE. Como cepas controles de los experimentos se utilizaron los virus HSV tipo 1 y la cepa 234/91 IPK identificada como Cox A9. Todas las cepas utilizadas fueron crecidas en células Vero y previamente tituladas.
Neutralización por ECP. Fueron mezclados 0,2 mL de diluciones seriadas en base 10 de la cepa 47/93 IPK con igual volumen de una dilución de 1/100 del suero hiperinmune a la propia cepa, obtenido en conejos mediante inmunizaciones sucesivas y con un título de 1/10 000. Después de 4 horas de incubación a 37 oC las mezclas fueron inoculadas en cultivos de células Vero y mantenidas a igual temperatura. Diariamente se realizó la observación de la aparición del ECP.
Método de purificación. La cepa 589/93 CIGB fue multiplicada en células Vero crecidas en frascos roller a una multiplicidad de infección igual a 0,1. Cuando el ECP fue máximo se realizó la cosecha viral. Después de 3 ciclos de congelación y descongelación rápidas, se centrifugó a 2 500 r.p.m. durante 20 min a 4 oC. El sobrenadante se mantuvo a 4 oC hasta el posterior procesamiento de las células. Las células fueron congeladas y descongeladas por 5 veces y sonicadas durante 15 segundos a 15 Herzios en 3 ocasiones. El sobrenadante celular fue recogido previa centrifugación a 10 000 r.p.m. por 10 min y añadido al primer sobrenadante. El virus fue precipitado con polyetienglicol (PEG) 6 000 y ClNa (2 %) en agitación durante 18 h a 4 oC. Posteriormente se centrifugó a 10 000 r.p.m. durante 1 hora. El pellet se disolvió en PBS conteniendo 2 % de BSA en un volumen de 1/50 del inicial sonicándose en igual forma a la descrita anteriormente. El material sonicado fue centrifugado a 7 300 r.p.m. durante 10 min. Posteriormente se concentró por AMICON hasta un volumen de 6 mL aplicándose 2 mL a cada tubo de un gradiente continuo de sacarosa (15-60 %) en buffer Tris 10mM pH 7,4; 50 mM NaCl centrifugándose durante 6 horas a 35 000 r.p.m.
Procesamiento de las fracciones. Las fracciones obtenidas a partir del gradiente de sacarosa fueron inoculadas en cultivos de células Vero y se realizó la observación diaria del ECP. En un caso, la fracción 11 (F11), se realizaron varios pases en células Vero en presencia y ausencia de ácido fosfonacético (PAA) a concentración final de 100 mg/mL.
Caracterización de los aislamientos. Se estudió la sensibilidad de las cepas aisladas frente al cloroformo, cloruro de guanidina (GCHl) y PAA. La metodología seguida ha sido descrita previa mente.2
Considerando la posibilidad de que 2 agentes de características culturales diferentes pudieran estar presentes en las mismas muestras, intentamos demostrar la presencia simultánea del agente productor de ECP-L y una de las cepas típicas de Enterovirus aislada del LCR de un paciente con NE; y por otra parte, purificar a partir de un aislamiento de las cepas productoras del ECP-L el posible segundo agente.
Para realizar lo primero, se neutralizó la cepa 47/93 IPK, identificada como Cox A9 con su suero hiperinmune obtenido en conejos. Se mezclaron diluciones seriadas del virus en presencia de una concentración constante de los anticuerpos. Posterior a una incubación de 4 horas, dichas mezclas se inocularon en cultivos de células Vero. Pudo observarse neutralización del ECP típico de Enterovirus hasta la dilución de 106 del virus. No obstante, a partir del quinto día de posinoculación comenzó a observarse en la dilución 104 la aparición de un ECP que recordaba al de los agentes productores de ECP-L. Este ECP se mantuvo con características similares durante los 3 pases siguientes realizados en cultivos de células Vero previa neutralización del agente con el mismo suero hiperinmune en dilución de 1/100. Estudios posteriores demostraron su susceptibilidad frente al PAA.
Las fracciones obtenidas del gradiente de sacarosa realizado a la cepa 589/93 CIGB fueron inoculadas en cultivos de células Vero, se observó en la mayoría el ECP de tipo ligero y en algunas la coexistencia de este efecto con focos aislados típicos de Enterovirus (figuras 1-3), los cuales no pudieron ser propagados por pases seriados en el mismo sistema celular. A uno de estos cultivos, inoculado con la fracción 11 que correspondió a la banda observada una vez corrido el gradiente, se le realizaron 2 pases seriados en células Vero en presencia de PAA. A partir de este pase se desarrolló un ECP típico de Enterovirus que pudo mantenerse por pases sucesivos en las mismas células y que alcanzó un título de 108 TCID50. Este agente, al que se denominó F11/94 IPK, fue resistente al cloroformo y sensible al GHCl disminuyendo su título viral en 5 logs.
Con el objetivo de identificarlo se realizó la prueba de neutralización en presencia de sueros hiperinmunes de referencia utilizados en la clasificación de los Enterovirus4 y frente a un suero hiperinmune contra la cepa 590/93 CIGB productora de ECP-L. El agente fue neutralizado por todos los pools de sueros utilizados, por lo que no pudimos definir su identidad definitiva pero sí comprobar su estrecha relación con los Enterovirus. Por otra parte su ECP fue neutralizado por el suero contra la cepa 590/93 CIGB, lo que demuestra una vez más la comunidad antigénica entre el Enterovirus y el agente de ECP-L o la presencia de los 2 agentes en la misma muestra.
]]> Estos resultados demuestran que ambos agentes están presentes en las mismas muestras predominando en algunas el Enterovirus y en otras el agente productor del ECP-L. Se necesita continuar profundizando en el posible papel de ambos en la etiopatogénesis de la enfermedad.Queremos dejar constancia de nuestro agradecimiento a la UNESCO por haber financiado en parte esta investigación.
<1Doctor en Ciencias Médicas. Especialista de II Grado en Microbiología.
<2Especialista de I Grado en Microbiología.
<3Licenciada en Radioquímica.
<4Licenciada en Microbiología.
<5Licenciado en Microbiología. Investigador Auxiliar.
<6Licenciada en Microbiología. Investigadora Agregada.
Recibido: 19 de diciembre de 1994. Aprobado: 13 de febrero de 1995.
Dra. María G. Guzmán. Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí". Apartado 601, Marianao 13, Ciudad de La Habana, Cuba.
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