Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí"
Dra. SONIA RESIK,<1 Dra. MARIA G. GUZMAN,<2 Lic. ROSMARI RODRIGUEZ,<3 Lic. MAYLING ALVAREZ,<4 Lic. LUIS MORIER,<5 Lic. AIDA CASTILLO<6 y Dr. PEDRO MAS2
En el presente reporte se describen algunos factores que influyen en el crecimiento del agente productor del efecto citopático (ECP) ligero aislado a partir de líquido cefalorraquídeo de pacientes de neuropatía epidémica. Se demostró que la concentración de NaHCO3 fue decisiva para la aparición del ECP. Concentraciones determinadas de MnCl2 permitieron la visualización del ECP e incrementaron el rendimiento viral.
Palabras clave: NEURITIS/líquido encefalorraquídeo; EFECTO CITOPATOGENICO VIRAL; CELULAS VERO; ALLIUM CEPA/aislamiento & purificación.
Durante el brote de neuropatía epidémica (NE) ocurrido en Cuba entre los años 1991-1993 se aisló, a partir de muestras de líquido cefalorraquí deo (LCR) de pacientes, un agente productor de un efecto citopático ligero (ECP-L) en cultivos de células Vero.1
El aislamiento de este virus se hizo posible por el reconocimiento de un débil efecto citopático en los bordes de la monocapa celular en tubos sembrados con estas células.2 En los primeros pases la lectura de éste no era fácil por ser ligero y de progresión débil.
El presente reporte describe varios factores que influyen en que el ECP producido por estos agentes se haga más evidente.
Células. Se utilizaron cultivos de células Vero (ATCC) crecidas en medio 199 con suero de ternero fetal al 10 % y mantenidas posteriormente en el mismo medio y suero de ternero al 5 %.
Virus. Para los estudios se utilizó la cepa 44/93 IPK aislada en células Vero a partir del LCR de un paciente con neuropatía epidémica y productora de un efecto citopático ligero (ECP-L). En el momento del estudio la cepa contaba con 2 pases en MDCK y 3 pases en células Vero.
]]> Efecto de la concentración de NaHCO3 sobre el crecimiento viral. Cultivos de células Vero sembradas en tubos de cristal fueron inoculados con 0,1 mL de una dilución 1/50 del virus. Después de 1 hora de adsorción a 37 oC se añadió medio de mantenimiento conteniendo diferentes concentraciones de NaHCO3 (0,09; 0,105; 0,2 y 0,25 %). Diariamente se realizó la observación del ECP y al sexto día se realizó la cosecha viral. Cada cultivo fue congelado y descongelado 3 veces realizando posteriormente la titulación del virus mediante el método de Reed y Muench.3Efecto de la temperatura sobre el crecimiento viral. Cultivos de células Vero preparados e inoculados en forma similar a la descrita en el párrafo anterior fueron mantenidos a diferentes temperaturas (37, 33 y 37 oC después de un choque térmico a 40 oC durante media hora todos los días). Diariamente se realizó la observación del ECP y posterior a la cosecha viral se realizó la titulación viral.
Efecto del MnCl2 y del MgCl2 sobre el crecimiento viral. Para este estudio se trabajaron las cepas 44/93 IPK, la 47/93 IPK (identificada como Coxsackie A9 y aislada de un paciente de neuropatía epidémica) y una cepa de referencia de Herpes simple tipo 1 (HSV). Estas fueron diluidas desde 101 a 107, y 0,1 mL de cada dilución se inoculó en cultivos de células Vero crecidas en placas plásticas de 24 pozuelos. Después de 1 hora de adsorción a 37 oC se añadió el medio de mantenimiento en 3 formas: solo, conteniendo 0,5 mM de MnCl2 o 0,1 mM de MgCl2. Diaria mente se realizó la observación del ECP.
Efecto de la concentración de NaHCO3 en el medio de cultivo. No se observaron diferencias en el rendimiento viral a las concentraciones de NaHCO3 estudiadas; sin embargo, la aparición del ECP fue más temprana (24 horas) a concentraciones de 0,105 % que con el resto. La más elevada concentración utilizada retardó marcadamente la aparición e intensidad del ECP.
Efecto de la temperatura. Al crecer la cepa 44/93 IPK a diferentes temperaturas se observó un incremento de 2 logs en el título infectivo en aquellos cultivos mantenidos a 33 oC.
Efecto de MnCl2 y MgCl2 sobre el crecimiento viral. El crecimiento del virus no fue afectado al crecerlo en presencia de MgCl2 a la concentración estudiada. Se observó un incremento de 2 logs en el título infectivo y en la rapidez de aparición del ECP de la cepa 44/93 IPK cuando se creció en presencia de MnCl2. No se observaron cambios en el título infectivo de la cepa 47/93 IPK en presencia de MnCl2 y sí una inhibición de 4 logs del título infectivo del HSV.
Como se ha reportado en trabajos previos,1 en los inicios del brote de neuropatía epidémica se trabajó para descartar la posible causa viral de esta entidad. Muestras de LCR de pacientes fueron inoculadas en varios tipos de cultivos celulares y se observó en las células Vero la aparición de un ECP ligero, de progresión lenta, que en ocasiones desaparecía con los pases y era de difícil visualiza ción.2
Debido a la dificultad en su observación, decidimos estudiar algunos factores que pudieran influir en el cultivo de los agentes productores de ECP-L.
La concentración de NaHCO3 en el medio de mantenimiento resultó de vital importancia para evidenciar el ECP, principalmente en los primeros pases de los aislamientos hasta su establecimiento como cepas. Se obtuvieron mejores resultados cuando se creció el virus a pH neutro, mientras que altas concentraciones de NaHCO3 inhiben casi completamente el ECP. Ito et al. (comunicación personal) reportaron la presencia en el aislamiento 44/93 IPK del virus de Inoue-Melnick, el cual ha sido clasificado como un virus relacionado con la familia Herpesviridae, los que no se multiplican bien a pH muy alcalinos.4 Esto está en correspondencia con lo observado en nuestro estudio.
A pesar que el crecimiento del virus fue mejor a 33 oC, a medida que el aislamiento se adaptaba a crecer en el sistema celular se lograron títulos elevados a la temperatura usual de mantenimiento (37 oC). Se ha reportado que el HSV 1 es relativa mente estable a pH 5,5-9,5 a 26 oC.4
]]> En trabajos previos (Más et al. comunicación personal) se demostró que en varias muestras de LCR de pacientes, concentraciones determinadas de ZnCl2 aceleraban la aparición del ECP incrementando su intensidad cuando eran inoculadas en cultivos de células Vero que contenían esta sustancia en el medio de mantenimiento. Considerando lo anterior decidimos estudiar la acción de otras sustancias sobre el ECP de los agentes de ECP-L con el objetivo de evidenciar éstos. Pudo observarse que concentraciones determinadas de MnCl2 aumentaron el título viral de la cepa 44/93 así como su ECP, elemento contrapuesto con lo ocurrido al HSV utilizado que disminuyó su título infectivo en 4 logs.El MnCl2 inhibe la multiplicación de los virus Herpes cuando se encuentra en el medio de mantenimiento celular.4 No podemos descartar que el incremento en el título infectivo observado en la cepa 44/93 crecida en medio de mantenimiento que contiene MnCl2 se debiera a una inhibición del virus de Inoue-Melnick, permitiendo que el agente productor del ECP-L incrementara su título viral de existir algún tipo de interferencia entre ambos.
Queremos dejar constancia de nuestro agradecimiento a la UNESCO por haber financiado en parte esta investigación.
<1Especialista de I Grado en Microbiología.
<2Doctor en Ciencias Médicas. Especialista de II Grado en Microbiología.
<3Licenciada en Radioquímica.
<4Licenciada en Microbiología.
<5Licenciado en Microbiología. Investigador Auxiliar.
<6Licenciada en Microbiología. Investigadora Agregada.
Recibido: 10 de noviembre de 1994. Aprobado: 13 de enero de 1995.
Dra. Sonia Resik. Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí". Apartado 601, Marianao 13, Ciudad de La Habana, Cuba.