Identificación de una fuente humana de alimentación de mosquitos mediante la técnica de coaglutinación

Lic. MAYDA CASTEX,¹ Lic. ALBERTO FACHADO² y Dr. LUIS FONTE³

1. Licenciada en Ciencias Biológicas. Investigadora Agregada.
2. Licenciado en Bioquímica. Investigador Auxiliar.
3. Especialista de I Grado en Inmunología. Investigador Auxiliar.

RESUMEN

Se describe la utilización de la técnica de coaglutinación para la identificación de una fuente humana de alimentación de mosquitos. La dilución de las muestras de sangre ingerida en papel de filtro se hizo en 2 mL de una solución de cloruro de sodio al 0,85 %. Se utilizó una suspensión de estafilococos sensibilizados con un suero normal de conejo como control negativo. La suspensión de Staphylococcus aureus sensibilizados con suero de conejo anti-proteínas plasmáticas humanas y suero de conejo anti-IgG humana discriminó bien entre sangre humana y no humana. No se observó aglutinación con el control negativo. Esta técnica resultó ser sensible para identificar el 100 % de las muestras de sangre humana llevadas al papel 24 h después de que los mosquitos completaron su alimentación a una temperatura de 26 a 28 °C. En mosquitos alimentados y colectados en el campo, la prueba se comportó de forma satisfactoria, en consecuencia puede ser utilizada en trabajos de rutina en el campo. Los resultados mostraron la sensibilidad y especificidad de este método para la identificación de sangre humana ingerida por mosquitos.

Descriptoes DeCS: TEST DE AGLUTINACION/métodos; PROTEINAS SANGUINEAS/inmunología; STAPHYLOCOCCUS AUREUS/aislamiento & purificación; MOSQUITOS.

La identificación de los diferentes hospederos utilizados por los mosquitos en la naturaleza y la habilidad para identificarlos, es una parte integral de muchas investigaciones ecológicas que adquieren una gran importancia en los estudios epidemiológicos cuando las especies de mosquitos son de importancia médica.

Se han introducido numerosas técnicas inmunológicas para la identificación del origen de la sangre ingerida por artrópodos vectores. El reciente desarrollo en la tecnología basada en principios inmunológicos ha ofrecido amplias posibilidades de utilización de nuevas pruebas con este propósito.^1-6

La técnica de coaglutinación es un sistema de diagnóstico con un amplio espectro de aplicación. Inicialmente fue utilizada para la detección e identificación de serogrupos de Streptococcus.⁷ Este método también ha sido utilizado para detectar infecciones de Salmonella sp, Neisseria meningitidis y Rotavirus, de igual forma se ha utilizado para la detección de antígenos de Naegleria y Giardia,^8,9 así como antígenos de Toxoplasma gondii en orina de ratón.¹⁰ Recientemente, la técnica de coaglutinación ha sido utilizada para el diagnóstico de Dirofilaria immitis en perros.¹¹

El presente trabajo ofrece los datos de la técnica de coaglutinación para la detección de sangre humana ingerida por mosquitos.

MÉTODOS

Preparación y sensibilización de Staphylococcus aureus. El cultivo de Staphylococcus aureus cepa Cowan I se realizó en "ccy" modificado.¹² Las bacterias se fijaron con formaldehído al 2 % en PBS y se trataron con calor según el método descrito por Jonsson y Kronvall.¹³ Antes de la sensibilización con el antisuero, la suspensión bacteriana fue lavada 3 veces en PBS. Se tomó 1 mL de una suspensión al 10 % (w/v) de S. aureus en PBS, se mezcló con 0,5 mL de suero de conejo anti-humano y se incubó a 37 ^°C durante 3 h. Los estafilococos sensibilizados fueron lavados y resuspendidos en una concentración final de 5 % (w/v) en PBS que contenía azul de metileno al 0,4 % y azida sódica al 0,1 %. Para sensibilizar los estafilococos se utilizaron sueros de conejo anti-humano de Welcome Foundation (suero de conejo anti-humano; KA 08) y anti-IgG humana (preparado como se describe más adelante) en el rango de 200 mL de anti-suero por 1 mL de cultivo de estafilococo al 10 % en buffer fosfato salina (PBS) pH 7,2 - 7,4.

Producción de suero de conejo anti-IgG humana. El suero anti-IgG humana fue obtenido en conejo mediante inmunizaciones repetidas por inoculaciones subcutáneas con 1 mL de solución 0,01 % de IgG en agua bidestilada mezclada en igual volumen con adyuvante completo de Freund o incompleto de Freund según el caso. El adyuvante completo de Freund sólo fue utilizado en la primera inyección.

Se realizaron 4 inoculaciones con intervalos de 2 semanas. Los conejos inoculados fueron desangrados por punción cardíaca cuando el título fue adecuado (1:10 000) y el suero se conservó a -20 ^°C. La actividad del antisuero fue comprobada mediante el método de doble inmunodifusión.

Prueba de laboratorio. Se utilizaron hembras de Culex quinquefasciatus mantenidas a una temperatura de 26 a 28 ^°C en el insectario del Departamento de Control de Vectores del Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí" (IPK). Los mosquitos fueron alimentados con esponjas (7,5x3 cm) que contenían sangre: la sangre humana fresca y de diferentes animales (perro, gato, vaca, caballo, gallina, carnero, rata y curiel) se mezclaron con Heparina (5 unidades de Heparina/mL de sangre) y fue ofrecida a los mosquitos a 37 ^°C a través de la malla de la caja de cría. Los mosquitos que se alimentaron fueron extraídos y colocados en grupos de 30 individuos en pequeñas cajas de cartón, posteriormente se aplastaron sobre el papel de filtro Whatman No. 1 a diferentes intervalos de tiempo después de la alimentación. Los mosquitos del primer grupo fueron muertos inmediatamente que completaron su alimentación sanguínea; los otros grupos fueron muertos a las 8, 12, 24, 32 y 48 h después de la alimentación.

Otro grupo de mosquitos fue alimentado con una mezcla de sangre humana y bovina en rangos de 1:10 y 1:100, repectivamente. Las muestras en papel de filtro fueron almacenadas en placas de Petri a 4 ^°C.

Antes de desarrollarse la técnica, a las muestras en papel de filtro se les cortó el papel excedente y se colocaron en 2 mL de una solución de NaCl al 0,85 % por un período mínimo de 1 h a la temperatura de refrigeración (4 ^°C).

Para evaluar la sensibilidad de la técnica que se iba a emplear se probaron diluciones seriadas de suero humano normal e IgG purificada. Para comparar los resultados se utilizó la técnica de doble inmunodifusión de Castex y otros.¹⁴

Ensayos de campo. Se colectaron mosquitos hembras completamente alimentados en diferentes sitios de reposo tales como casas, vaquería, etcétera, de las especies: Mansonia titillans, Culex nigripalpus, Anopheles albimanus, Anopheles vestitipennis y Coquilletidia nigricans y fueron enfrentados con estafilococos sensibilizados con suero de conejo anti-humano y anti- -IgG humana y suero normal de conejo.

Procedimiento. La técnica de coaglutinación consiste en unir 1 gota (50 mL) de la dilución de la sangre ingerida por el mosquito con 1 gota (50 mL) de los estafilococos sensibilizados con los antisueros descritos, si la reacción es positiva la aglutinación se observa a los 2 min.

RESULTADOS

Preparación de la dilución de las muestras de sangre. Los mejores resultados en la dilución de las muestras de sangre sobre papel de filtro se obtuvieron cuando ésta se realizó en 2 mL de NaCl al 0,85 %.

FIGURA. Identificación de sangre humana ingerida por Culex quinquefasciatus en diferentes tiempos después de finalizada su alimentación.

Sensibilidad. La tabla 1 muestra los resultados de la sensibilidad de la técnica de coaglutinación. Se obtuvieron reacciones positivas con la IgG humana con concentraciones de 0,00001 mg/mL y con el suero de la misma especie diluido 1:80 000.

TABLA 1. Resultados de la técnica de coaglutinación en diferentes diluciones de IgG humana y suero normal humano

Especificidad. La especificidad de la técnica de coaglutinación se observa en la tabla 2, la identificación correcta de la sangre humana se realizó en todos los casos donde ésta estuvo presente.

TABLA 2. Resultados de la técnica de coaglutinación utilizado Culex quinquefasciatus alimentos con diferentes tipos de sangre

La técnica discriminó bastante bien entre sangre humana y no humana, sólo se observaron reacciones cruzadas en un bajo porcentaje: 3,3 %, cuando los estafilococos estaban sensibilizados con suero de conejo anti-humano y 1,4 % de reacción cruzada cuando la sensibilización se realizó con suero de conejo anti-IgG humana.

Prueba de campo. Los resultados de la técnica de coaglutinación usando suero de conejo anti-humano y comparados con los obtenidos con la técnica de doble inmunodifusión en gel, llevada a cabo con mosquitos colectados en el campo, se muestran en la tabla 3.

TABLA 3. Resultados de la técnica de coaglutinación y doble inmunodifusión en diferentes especies de mosquitos colectados en distintos sitios de reposo en una localidad de la provincia de La Habana

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			Coaglutinación para sangre humana		Doble inmunodifusión para sangre humana
Especies	Naturaleza del refugio	No. de muestras	Positivos	]]> Negativos	Positivos	Negativos
Mansonia titillans	Humana	18	14	4	11	7
]]>	Vacuna	3	1	2	-	3
	Mixta	13	]]> 9	4	6	7
Culex nigripalpus	Humana	2	2	-	1	]]> 1
	Vacuna	9	5	4	-	9
	Mixta	]]> 8	4	4	3	5
Coquillerida nigricans	Humana	8	7	1	]]> 6	2
	Mixta	5	5	-	3	2
Anopheles albimanus	]]> Humana	13	11	2	10	3
	Vacuna	3	-	]]> 3	-	3
	Mixta	7	3	4	2	5
]]> Anopheles vestitipennis	Humana	5	4	1	4	1
	Vacuna	5	]]> 1	4	-	5
	Mixta	4	1	3	-	]]> 4
Total		103	67	36	46	57

Estabilidad. Los reactivos se mantuvieron estables por 6 meses a la temperatura de refrigeración (4 ^°C).

DISCUSIÓN

Es conocido que en condiciones tropicales la sangre ingerida por los mosquitos se digiere completamente dentro de 24 a 48 h, en este estudio se detectó sangre humana en las muestras con 32 h de digestión, estos resultados son comparables con la técnica de ELISA sandwich,¹⁶ ELISA Microdot¹⁷ y ELISA Dipstic.¹⁸

En este ensayo se detectaron las diluciones de las muestras de sangre en papel de filtro en 2 mL de solución salina, esta sensibilidad debe ser suficiente para muestras de sangre ingerida por artrópodos pequeños y en este caso la dilución adecuada de la muestra puede ser adaptada para su detección.

La técnica de coaglutinación fue capaz de distinguir la sangre humana ingerida por los mosquitos si se utilizaba tanto el suero de conejo anti-humano como el suero de conejo anti-IgG humano. La IgG resultó ser mejor antígeno marcador para la detección de la sangre ingerida por los mosquitos. Las inmunoglobulinas son suficientemente diferentes entre las especies y ellas están presentes en concentraciones altas en las sangres ingeridas,¹⁹ aunque se ha confirmado la posibilidad de reacción cruzada de algunos anticuerpos monoclonales, levantados contra IgG humana, con IgG de otras especies.²⁰ Se observó un pequeño porcentaje de reacción cruzada en las muestras de sangre no humana utilizadas. Se coincide con Service y otros,¹⁶ y Lindquist y otros²¹ en que la IgG es el mejor candidato como marcador y el suero anti-IgG puede contribuir sustancialmente a la elucidación de relaciones zoológicas entre especies de animales estrechamente relacionadas.

Se observó que en condiciones de campo (tabla 3) la técnica de coaglutinación es más sensible que la difusión en gel, para la identificación de sangre humana ingerida por los mosquitos. De acuerdo con estos resultados se propone el uso de la técnica de coaglutinación⁶ en la identificación de sangre humana ingerida por los mosquitos en condiciones de campo. Este método es sensible, específico, simple, rápido, barato y no requiere equipamiento especial.

SUMMARY

The utilization of a coagglutination technique for the identification of a human source for feeding mosquitoes is described. The dilution of ingested blood samples in filter paper was performed in 2 mL of a sodium chloride solution at 0.85 %. It was used a suspension of sensibilized Staphylococcus aureus with rabbit's serum, human plasmatic anti-proteins, and human anti-IgG rabbit's serum discriminated well between human and non human blood. No agglutination was observed with the negative control. This technique proved to be sensitive to identify 100 % of the human blood samples taken to the paper 24 hours after the mosquitoes completed their feeding at a temperature of 26 to 28 °C. Among mosquitoes fed and collected in the fields the test had a satisfactory result. Therefore, it may be used in routine work in the fields. The results showed the sensitivity and specificity of this method for identifying human blood ingested by mosquitoses.

Subject headings: AGGLUTINATION THESIS/methods; BLOOD PROTEINS/immunology; STAPHILOCOCCUS AUREUS/isolation & purification; MOSQUITOES.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Weitz B. Identification of blood meals of blood-sucking arthropods. Bull World Health. Organization 1956;15:473-90.
2. Tempelis CH. Host-feeding patterns of mosquitoes with a review of advances of analysis of blood meals by serologic. J Med Entomol 1975;1:635-53.
3. Washino RK. Tempelis CH. Mosquito host blood meal identification: methodology and data analysis. Ann Rev Entomol 1983;28:79-201.
4. Irby WS. Immunoblot analysis of digestion of human and rodent blood by Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). J Med Entomol 1989;26:284-93.
5. Hunter FF, Bayly R. ELISA for identification of blood meal source in black flies (Diptera: Simuliidae). J Med Entomol 1989;28:527-32.
6. Sato C, Furuya Y, Harada M, Suguri S. Identification of human blood in mosquito (Diptera:Culicidae) using nonradioactive DNA dot bolt hybridization. J Med Entomol 1992;29:1045-8.
7. Finch RG, Philips I. Serological grouping of streptococci by slide coagglutination method. J Clin Path 1977;30:168-70.
8. Kilvintong S, White DG. Identification of Naegleria fowleri in fresh isolates of enviromental amoebas using staphylococcal coagglutination technique. Trans R Soc Trop Med Hyg 1986; 80:564-9.
9. Sherman RA, Moody AH. Giardia antigen and antibody detection using coagglutination. Serodiag immunother Inf Dis 1990;4:231-4.
10. Fachado A, Fonte L,Rojas L, Alberti E, Machín R. Technique for the detection of Toxoplasma gondii antigens in mouse urine. Mem Inst Oswaldo Cruz 1990;85:65-8.
11. Rojas L, Duménigo B, Fonte L, Fachado A, Finlay CM. Identification of Dirofilaria immitis infected dogs with a coagglutination assay. J Parasitol 1992;78:166-8.
12. Arvidson S, Holme T, Wadstrom T. Influence of cultivation conditions on the production of extracellular proteins by Staphylococcus aureus. Acta Pathol Microbiol Scand 1971; 79:399-405.
13. Jonsson S, Kronvall G. The use of protein A containing Staphylococcus aureus as a solid phase anti-IgG reagent in radioimmunoassay as a exemplified in the quantitation of alphafetoprotein in normal human adult serum. Eur J Immunol 1974;4:29-33.
14. Castex M, Suárez E, Marquetti MC. Food source of Culex quinquefasciatus Say, 1823 (Diptera: Culicidae) in Machurrucutu locality, Havana Province, Cuba. Mem Inst Oswaldo Cruz 1990;85:241-2.
15. Collins RT, Dash BK, Agarwala RS, Dhal KB. An adaptation of gel diffusion technique for identifying the source of mosquito blood meals. Indian J Malariol 1986;23:81-9.
16. Service MW, Voller A, Bidwell DE. The enzime-linked immunosorbent assy (ELISA) test for the identification of blood meals of haematophagous insects. Bull Entomol Res 1986;76:321-30.
17. Roy A, Sharma VP. Microdot ELISA: development of a sensitive and rapid test to identify the source of mosquito blood meals. Indian J Malariol 1987;24:51-8.
18. Savage HM, Duncan JF, Roberts DR, Sholdt LL. A dipstick ELISA for rapid detection of human blood meals in mosquitoes. J Am Mosq Control Assoc 1991;7:16-23.
19. WHO. Development of new tecniques for the identification of host blood meals in arthropod vector. Report of the interlaboratory trial 1986-1987. WHO/VBC/87.947 1987:12.
20. Jefferis R, Lowe J, Ling MR, Porter R, Senior S, Immunogenic and antigenic epitopes of immunoglobulins I. Crossreactivity of murine monoclonal antibodies to human IgG with the immunoglobulins of certain other species. Immunology 1982;45:71-7.
21. Lindquist KJ, Gathuma JM, Kaburia HFA. Analysis of blood meals of haematophagous insects by haemagglutination inhibition and enzyme immunoassay. En: Tukei PM, Njogu AR, eds. Current medical research in Eastern Africa with emphasis on zoonoses and waterborne diseases. Proceeding of the Third Annual Medical Conference. Nairobi: Afroscience International, 1982:122-33.

Recibido: 27 de noviembre de 1996. Aprobado: 18 de febrero de 1997.