Sensibilidad in vitro de Histoplasma capsulatum var. capsulatum frente a anfotericina B, ketoconazol, itraconazol y fluconazol

Lic. Carlos Manuel Fernández Andreu,1 Lic. Agner Martínez León,2 Lic. Yamilé Echemendía Medina,2 Dr. Gerardo Martínez Machín,3 Lic. Mayda R. Perurena Lancha4 y Dra. María Teresa Illnait Zaragozí3

Resumen

Se determinó la concentración mínima inhibitoria (CMI) mediante un micrométodo de dilución en caldo RPMI-1640, con el objetivo de conocer la sensibilidad a la anfotericina B, el itraconazol, el ketoconazol y el fluconazol de 29 cepas de Histoplasma capsulatum var. capsulatum aisladas en Cuba. La histoplasmosis es una de las principales micosis sistémicas al nivel mundial, cuya incidencia se ha incrementado en los últimos años, asociada principalmente a la infección por el VIH y a la aparición de nuevos brotes epidémicos en diferentes regiones. Los resultados obtenidos permitieron concluir que frente al fluconazol se encontraron valores altos de CMI, con una media geométrica de 55,5 µg/mL. Para la anfotericina B, el ketoconazol y el itraconazol todas las cepas fueron inhibidas a concentraciones bajas, con medias geométricas de 0,26, 0,17 y 0,125 µg/mL, respectivamente. El desarrollo por primera vez en Cuba de un método para la determinación de CMI de las principales drogas antifúngicas frente a H. capsulatum var. capsulatum, permitirá establecer los patrones de sensibilidad y detectar la aparición de resistencia, lo que contribuirá a un mejor conocimiento de esta importante micosis.

DeCS: HISTOPLASMOSIS/ QUIMIOTERAPIA; TEST DE SENSIBILIDAD MICROBIANA/ métodos; AGENTES ANTIFUNGICOS; HISTOPLASMA.

La histoplasmosis, infección causada por el hongo Histoplasma capsulatum var. capsulatum, se ha convertido en una de las micosis más estudiadas al nivel mundial y su incidencia ha aumentado en los últimos años, asociada fundamentalmente a la extensión de la pandemia de SIDA. En Cuba, su importancia social está dada, no solo por su relación con determinados grupos ocupacionales, sino también por su frecuente presentación en forma de brotes epidémicos.1

Antes de la aparición de los azoles, la única droga disponible para el tratamiento de la histoplasmosis era la anfotericina B, con sus conocidos efectos adversos. Sin embargo, en la actualidad, el arsenal terapéutico incluye, además de la anfotericina B (en su forma convencional y en sus nuevas presentaciones lipídicas), al ketoconazol, el itraconazol y el fluconazol.2

Con la disponibilidad de estas nuevas drogas antifúngicas y la aparición de cepas resistentes, las pruebas de sensibilidad in vitro se han convertido en una necesidad y han sido objeto de un creciente interés con vistas a lograr su estandarización y la adecuada correspondencia entre los resultados de laboratorio y la evolución clínica de los pacientes sometidos a tratamiento antimicótico.3 Con el objetivo de conocer la sensibilidad in vitro de 29 cepas de H. capsulatum var. capsulatum aisladas en Cuba, se determinó la concentración mínima inhibitoria (CMI) de anfotericina B, itraconazol, ketoconazol y fluconazol, mediante un micrométodo de dilución en caldo.

Métodos

Cepas de referencia: Candida parapsilosis ATCC 22019 (recomendada en el documento M27-A del Comité Nacional de Estándares de Laboratorio Clínico de los EE.UU.4) y Paecilomyces variotii ATCC 22319,5 como controles de calidad.

Agentes antifúngicos: las drogas utilizadas fueron la anfotericina B (Fungizone, Squibb), el itraconazol (Sporanox, Janssen), el ketoconazol (Nizoral, Janssen) y el fluconazol (Diflucan, Pfizer).

Solventes: se utilizó el dimetilsulfóxido (DMSO) a 100 % para el ketoconazol, el itraconazol y la anfotericina B; para el fluconazol se utilizó como solvente el agua destilada estéril.

Medios de cultivo: los medios empleados fueron el agar papa dextrosa (APD, Oxoid) para el cultivo de la fase filamentosa y el RPMI-1640 (Sigma) (en solución amortiguadora de ácido morfolinopropanosulfónico, MOPS, Sigma, 0,165 M, pH 7,0) para las pruebas de sensibilidad in vitro. Se utilizó además, el agar Sabouraud glucosado (ASG) para la determinación de las unidades formadoras de colonias (UFC).

Soporte: para la determinación de las CMI se emplearon placas estériles de poliestireno para microtitulación, de 96 pocillos con fondo en U.

Determinación de la concentración mínima inhibitoria

Preparación del inóculo: se prepararon suspensiones en solución salina fisiológica estéril de cada una de las cepas de H. capsulatum var. capsulatum y de P. variotii a partir de cultivos de 7-10 d de incubación a 28 °C en APD y la densidad óptica fue ajustada a 0,2 (530 nm); de cada una de ellas se tomaron 100 µL y se adicionaron a 5 mL de medio RPMI-1640. Para la determinación de las UFC se tomaron otros 100 µL de cada suspensión y se sembraron en placas de ASG.5

La suspensión de la cepa control de C. parapsilosis se preparó a partir de un cultivo de 24 h en ASG incubado a 30 °C y se ajustó su turbidez en correspondencia con el tubo 0,5 de la escala de McFarland. Se tomaron 50 µL de esta suspensión y se adicionaron a 5 mL de RPMI-1640, obteniéndose una concentración de 9,0 x 103 UFC/mL, lo cual fue comprobado mediante el conteo de colonias en ASG.4

Diluciones del antifúngico: se prepararon soluciones "madre"de anfotericina B, ketoconazol e itraconazol en DMSO y de fluconazol en agua destilada estéril, cada una con concentración de 2 mg/mL y a partir de estas se preparó una segunda solución de 1 280 µg/mL con agua destilada estéril. Después de repartir 20 µL de agua destilada estéril en cada pocillo, se tomaron 20 µL de esta solución y a partir de la columna 2 se realizaron diluciones dobles hasta la columna 11.

Determinación del punto final: las placas se incubaron en cámara húmeda hasta 7 d a 30 °C. Las lecturas se realizaron cuando se detectó crecimiento visible en los pocillos correspondientes al control sin drogas (columna 12). Para las drogas azólicas, la CMI se consideró como la menor concentración de antifúngico que mostró una marcada inhibición del crecimiento (³ 50 %) en comparación con el control sin droga, mientras que para la anfotericina B la CMI se definió como la menor concentración que fue capaz de producir 100 % de inhibición del crecimiento.5

Análisis estadístico: se calcularon las medias geométricas de los valores de CMI de las cepas frente a cada una de las drogas, así como los rangos, los porcentajes acumulativos y las CMI50 y CMI90 (las menores concentraciones que inhiben a 50 y 90 % de las cepas, respectivamente). Cuando la lectura de CMI fue superior a 64 µg/mL, se tomó el valor de 128 µg/mL para el cálculo de la media geométrica.

Resultados

Las concentraciones de los inóculos obtenidos a partir de la fase filamentosa de las cepas en estudio oscilaron entre 3,1 x 104 y 6,6 x 104 UFC/mL.

Los resultados de los valores de CMI, para las cepas de origen ambiental así como los rangos y las medias geométricas para cada una de las drogas se muestran en la tabla 1. Los valores de CMI de anfotericina B y ketoconazol estuvieron en un rango de 0,125-0,5 µg/mL, mientras que el fluconazol presentó un rango de valores de CMI de 32 a >64 µg/mL; todas las cepas fueron inhibidas con 0,125 µg/mL de itraconazol. Para las cepas de origen clínico, los valores obtenidos fueron muy similares a los de las cepas ambientales (tabla 2): el rango de CMI de anfotericina B fue de 0,125-1,0 µg/mL, mientras que el de ketoconazol fue de 0,125-0,25 µg/mL. El fluconazol mostró igualmente los valores más altos de CMI, con un rango de 16 a >64 µg/mL; la menor concentración utilizada de itraconazol fue suficiente para inhibir el crecimiento de todas las cepas estudiadas. No se encontraron diferencias entre las medias geométricas de los valores de CMI entre las cepas de origen clínico y las de origen ambiental.

En la tabla 3 se muestra el número total de cepas inhibidas y sus porcentajes acumulativos frente a cada una de las concentraciones de las drogas utilizadas, así como los valores de CMI50 y CMI90.
Para la anfotericina B se encontró que con 0,25 µg/mL se podía inhibir más de 50 % de las cepas (CMI50), mientras que la siguiente dilución (0,5 µg/mL) fue capaz de eliminar a 93 % (CMI90) (tabla 3).

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Los resultados obtenidos en el presente estudio mostraron una marcada inhibición de H. capsulatum var. capsulatum frente al ketoconazol, con un rango de CMI entre 0,125-0,5 µg/mL y una media geométrica de 0,17 µg/mL (tabla 3). Fueron inhibidas 20 cepas por la menor concentración de la droga, lo cual representa un valor de CMI50 de 0,125 µg/mL, mientras que 93 % mostró inhibición con la dilución siguiente, correspondiéndose con una CMI90 de 0,25 µg/mL.

Para el fluconazol, se obtuvo un rango de CMI entre 16 a >64 µg/mL, con media geométrica de 55,5 µg/mL (tabla 3). La CMI50 se alcanzó con 64 µg/mL, mientras que la CMI90 fue de >64 µg/mL.

Las cepas de C. parapsilosis y P. variottii utilizadas como control de calidad mostraron valores de CMI que se correspondieron con los de referencia,4,5 lo que sirvió para validar la actividad de los antifúngicos empleados.

Discusión

La estandarización del inóculo constituye el primer paso crítico en las pruebas de sensibilidad in vitro con agentes antifúngicos.7 En el presente trabajo se emplearon concentraciones semejantes a las utilizadas por Espinel-Ingroff (0,9-4,7 x 104 UFC/mL) en un estudio similar donde compara la actividad in vitro del voriconazol con la anfotericina B y el itraconazol. En particular, cuando se trata de hongos filamentosos este paso se hace mucho más difícil, porque la suspensión celular generalmente está formada por fragmentos de hifas de diferentes tamaños y por los distintos tipos de conidios.5

Las drogas utilizadas tienen su principal sitio de acción sobre el ergosterol de la membrana fúngica, el cual presenta pocas variaciones en la transición de micelio a levadura, proceso en el cual los cambios fundamentales se registran en la composición de a y b-glucanos al nivel de la pared celular.8-11

Al nivel mundial se han reportado pocos trabajos relacionados con la sensibilidad in vitro de los hongos filamentosos o dimórficos, fundamentalmente por la falta de estandarización en los métodos empleados.3,5 Para H. capsulatum var. capsulatum, por su naturaleza dimórfica, el problema de la estandarización del inóculo es mayor, porque los valores de CMI pudieran ser distintos para la fase filamentosa y la levaduriforme. En este caso, algunos autores recomiendan preparar la suspensión de células a partir de la fase levaduriforme, lo cual propor-cionaría un inóculo más homogéneo. Sin embargo, las levaduras de H. capsulatum var. capsulatum son mucho más difíciles de cultivar en el laboratorio que las formas filamentosas y requieren no solo una temperatura de 37 °C sino también medios de cultivo enriquecidos y complejos, los cuales no son recomendados para los estudios de drogosen-sibilidad in vitro.7,12

De las drogas mencionadas, la anfotericina B es la más efectiva in vivo y continúa siendo el antimicótico de elección para el tratamiento de las micosis sistémicas, asociadas o no con el VIH.13,14 Los resultados in vitro también confirman su alta eficacia, en particular frente a H. capsulatum var. capsulatum. En este caso, para el total de cepas, se obtuvo un rango de CMI y una media geométrica de 0,125-1,0 µg/mL y 0,26 µg/mL, respectivamente; lo cual se corresponde con los resultados obtenidos por Espinel-Ingroff en un estudio similar, donde encontró un rango de 0,25--0,5 µg/mL y una media geométrica de 0,42 µg/mL, partiendo de la fase filamentosa.5 Valores similares (0,05-1,0 µg/mL) fueron encontrados por Shadomy y Pfaller en 1991;15 Connolly y otros por su parte, obtuvieron valores más bajos, con una media y una CMI90 de 0,019 µg/mL.16

Polak y Dixon17 y Kobayashi y otros18 al estudiar la sensibilidad de diferentes cepas de H. capsulatum var. capsulatum en fase levaduriforme frente a la anfotericina B, encontraron rangos de CMI de 0,07-0,15 µg/mL y de 0,3-1,04 µg/mL respectivamente, los cuales se pueden considerar bastante cercanos a los obtenidos en el presente trabajo.

El itraconazol es más activo frente a H. capsulatum var. capsulatum que los otros azoles, porque además del blanco principal de estos (la enzima 14-a-demetilasa del lanosterol, dependiente del citocromo P450) tiene acción inhibitoria sobre otra enzima que también participa en la biosíntesis del ergosterol, la 3-ketosterol reductasa.19 Esta droga ofrece una alternativa efectiva para el tratamiento de pacientes con manifestaciones de histoplasmosis ligeras o moderadamente severas y para la complementación de la terapia en aquellos que hayan evolucionado después de un tratamiento corto con anfotericina B.16,20 Por su alta efectividad in vitro y los resultados obtenidos en el tratamiento de la histoplasmosis, algunos autores lo consideran el fármaco de elección en pacientes con SIDA.21

Frente al ketoconazol, los valores obtenidos en el presente trabajo coinciden con los de Shadomy y otros quienes obtuvieron una media geométrica entre 0,07 y 0,12 µg/mL, con una CMI90 de 0,1--0,2 µg/mL al comparar la sensibilidad in vitro de H. capsulatum var. capsulatum (fase filamentosa) en 3 medios de cultivo diferentes.22 Al comparar estos resultados con los de Heel23 y los de Polak y Dixon17 a partir de la fase levaduriforme, se observa que el rango encontrado por Heel estuvo entre 0,1-0,5 µg/mL, mientras que los segundos obtuvieron un rango entre 0,03-0,07 µg/mL. En ambos casos los resultados demuestran una alta efectividad in vitro del ketoconazol, esto se corresponde en gran medida con lo obtenido aquí, aunque con valores ligeramente superiores.

El ketoconazol fue el primer antifúngico imidazólico disponible por vía oral, y rápidamente se convirtió en una alternativa para el tratamiento de la histoplasmosis en pacientes inmu-nocompetentes. Sin embargo, hoy día se considera que no debe ser utilizado en la enfermedad diseminada progresiva o en pacientes infectados por el VIH con histoplasmosis diseminada, porque la respuesta al tratamiento es más lenta y no es tan efectivo como la anfotericina B o el itraconazol.14,20

La elevada disponibilidad oral y los reducidos efectos adversos del fluconazol, entre otros, son factores que han contribuido a su amplia utilización en el tratamiento de numerosas infecciones fúngicas.20 En el caso de la histoplasmosis, un tratamiento con dosis elevadas de fluconazol induce la remisión en la mayoría de los pacientes, sin embargo, muchos presentan episodios de recurrencia frente a la terapia sostenida con esta droga.24 En este sentido existen ciertas contradicciones, porque algunos autores como George y Penn14 afirman categóricamente que el fluconazol no debe usarse en el tratamiento de la histoplasmosis. Sin embargo, Bradsher plantea que este fármaco pudiera ser adecuado en pacientes que no toleren el itraconazol y en infecciones del sistema nervioso central por H. capsulatum var. capsulatum.25 En la actualidad se reconoce a este antimicótico como una de las 4 drogas disponibles para el tratamiento de la histoplasmosis.2, 21

La razón de la pobre respuesta del fluconazol frente a la histoplasmosis parece ser su reducida actividad antifúngica in vitro.24 En trabajos realizados por Polak y Dixon frente a la fase levaduriforme, los valores de CMI se encontraron en un rango de 0,25-5,0 µg/mL, con una media geométrica de 3,3 µg/mL,17 mientras que Kobayashi y otros obtienen valores mucho más elevados, que oscilan entre 16 a >64 µg/mL y 2,95-1 000 µg/mL.18 Wheat y otros reportaron la emergencia de resistencia al fluconazol como causa del fallo terapéutico en pacientes inmunodeprimidos, cuyas cepas de H. capsulatum mostraron valores de CMI ³ 5 µg/mL.26 Todos estos resultados sugieren la necesidad de emplear elevadas concentraciones de fluconazol in vitro para lograr la inhibición de H. capsulatum var. capsulatum, lo cual coincide con lo obtenido en el presente trabajo, donde los valores de CMI50 y CMI90 fueron de 64 y >64 µg/mL, respectivamente (tabla 3). Sin embargo, también se puede observar que, en los diferentes estudios realizados, existe una gran variabilidad entre cepas frente a este fármaco, por lo que sería conveniente continuar profundizando en la evaluación de los factores que influyen en este comportamiento.

Teniendo en cuenta la comparación de los resultados obtenidos para las 4 drogas a partir de la fase filamentosa de H. capsulatum var. capsulatum, con los encontrados por otros autores que parten de la fase levaduriforme, es importante señalar que estos últimos no difieren en gran medida de los aquí hallados. Este es un aspecto interesante y que debe tenerse en cuenta en los futuros trabajos relacionados con las pruebas de sensibilidad in vitro con hongos dimórficos.

El presente trabajo ha permitido determinar, por primera vez en Cuba, la sensibilidad de cepas autóctonas de H. capsulatum var. capsulatum frente a los 4 agentes antifúngicos más utilizados en la terapéutica actual de la histoplasmosis.

Summary

The minimum inhibitory concentration (MIC) was determined by a micromethod of dilution in RPMI-1640 broth in order to know the sensitivity to amphotericin B, itraconazole, ketoconazole and fluconazole of 29 strains of Histoplasma capsulatum var capsulatum isolated in Cuba. Histoplasmosis is one of the main systemic mycosis at the world level and its incidence has increased during the last years, associated mainly with HIV infection and to the appareance of new epidemic outbreaks in different regions. The results obtained allowed to conclude that high values of IMC against fluconazole were found with a geometric mean of 55.5 ug/mL. For amphotericin B, ketoconazole and itraconazole, all the strains were inhibited at low concentrations with geometric means of 0.26, 0.17 and 0.125 ug/mL, respectively. The development for the first time in Cuba of a method to determine the IMC of the main antifungal drugs against H. capsulatum var capsulatum will make possible to establish the sensitivity patterns and to detect the appearance of resistance, which will contribute to know this important mycosis better.

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Recibido: 20 de septiembre de 2002. Aprobado: 28 de marzo de 2003.
Lic. Carlos Manuel Fernández Andreu. Laboratorio de Micología, Instituto de Medicina Tropical “Pedro Kourí”. Apartado Postal 601. CP 11300, Ciudad de La Habana, Cuba. Correo electrónico: cfandreu@ipk.sld.cu

1 Licenciado en Microbiología. Investigador Auxiliar. ]]> 2 Licenciado en Microbiología.
3 Especialista de I Grado en Microbiología
4 Licenciada en Microbiología. Investigadora Agregada.