Susceptibilidad in vitro de aislamientos vaginales de Candida frente a clotrimazol y nistatina

Dra. Vilma Llovera Suárez1 y Dr. Carlos M. Fernández Andreu2

Resumen

Se determinó la susceptibilidad in vitro frente a clotrimazol y nistatina de 123 aislamientos de Candida, obtenidos mediante exudados vaginales de 404 mujeres que asistieron al Hospital Ginecoobstétrico "Ramón González Coro" de Ciudad de La Habana. De acuerdo con el número de colonias obtenidas en el aislamiento primario, las cepas fueron separadas en 2 categorías: colonización e infección. Para cada cepa se determinó la concentración mínima inhibitoria (CMI) de cada antifúngico, mediante un método de microdilución en caldo casitona. Las medias geométricas de los valores de CMI fueron mayores frente a nistatina (1,08 mg/mL) que frente a clotrimazol (0,22 mg/mL), aunque los rangos fueron similares (£ 0,125-16 mg/mL). Para Candida albicans, que fue la especie aislada con mayor frecuencia (54,5 %); las medias geométricas de los valores de la CMI fueron de 0,17 y 0,16 mg/mL para clotrimazol y de 0,71 y 0,92 mg/mL para nistatina, en ambas categorías. C. glabrata mostró el valor de CMI más elevado (16 mg/mL) frente a ambos antifúngicos. Solo los aislamientos de C. lusitaniae mostraron diferencia significativa (p < 0,01) entre los valores de CMI de nistatina de acuerdo con el número de colonias en el aislamiento primario. En aislamientos procedentes de mujeres tratadas con clotrimazol y/o nistatina en episodios anteriores de candidiasis, se observaron valores más elevados de las medias de CMI frente a nistatina que frente a clotrimazol; aunque esta diferencia no fue estadísticamente significativa.

DeCS: TEST DE SENSIBILIDAD MICROBIANA/ métodos; CANDIDA; CLOTRIMAZOL; NISTATINA; IN VITRO.

Con la aparición de las primeras cepas de Candida albicans que no respondían a los tratamientos antimicóticos, surgió la necesidad de la realización de las pruebas de susceptibilidad in vitro a estas drogas.1,2
]]> En diferentes estudios realizados se ha observado que algunas cepas de C. albicans pueden cambiar de sensibles a resistentes después de la administración de drogas antimicóticas;3 en particular, se ha señalado que una exposición previa a fluconazol hace que las cepas se tornen resistentes a anfotericina B, lo cual pudiera tener grandes implicaciones clínicas.4,5

En los últimos años se ha reportado un incremento de las infecciones orales y vaginales recurrentes causadas por Candida, lo que ha sido asociado a diferentes biotipos de C. albicans para cada episodio y/o al cambio del fenotipo de la colonia en la infección vaginal; y a la vez relacionado con el recuento de linfocitos T CD4+ en pacientes inmunocomprometidos.6 Adicionalmente, otros reportes señalan que los cambios en el biotipo se acompañan por cambios en la sensibilidad y el desarrollo de resistencia a los agentes antifúngicos cuando se han aplicado tratamientos por tiempo prolongado.7

En este sentido, Leite y otros (1997), en un estudio para evaluar la similitud de cepas de C. albicans aisladas de mujeres embarazadas con vaginitis recurrente mediante morfotipo, genotipo y resistencia a los antifúngicos, concluyen que la recurrencia de la enfermedad está determinada por la persistencia de un genotipo único que sufre cambios morfológicos y conductuales en presencia de agentes antifúngicos debido a presión selectiva.3

En Cuba, las infecciones vaginales por Candida generalmente son tratadas con nistatina o clotrimazol, por ser los antifúngicos más asequibles; sin embargo, se observan recidivas en muchos casos. Por otra parte, son pocos los estudios realizados en el país para conocer la sensibilidad in vitro de las cepas a estos agentes.8-10 Por esas razones, este estudio se propone determinar la concentración mínima inhibitoria (CMI) de clotrimazol y nistatina en cepas de Candida aisladas de exudados vaginales e investigar su relación con la administración previa de antimicóticos.

Métodos

El estudio se realizó a 123 cepas de Candida aisladas de una población de 404 mujeres que acudieron al Laboratorio de Microbiología del Hospital Ginecoobstétrico "Ramón González Coro" de Ciudad de La Habana durante los meses de julio y agosto de 1999, referidas de las consultas de ginecología y obstetricia para practicarles exudado vaginal. De cada paciente se recogieron datos clínicos y epidemiológicos relacionados con el motivo de consulta.
Para el aislamiento primario, cada exudado fue sembrado en placas de agar Sabouraud cloranfenicol e incubadas por 48-72 h a 28 °C. Se realizó un recuento del número de colonias obtenidas, lo que permitió clasificarlas en 2 categorías de acuerdo con el criterio de Higashide y otros: colonización (hasta 10 colonias) e infección (más de 10 colonias).11 Las colonias de levaduras fueron subcultivadas en agar Sabouraud e identificadas mediante la producción de tubos germinativos y clamidoconidias y la prueba de asimilación de carbohidratos.12

Resultados

De las 404 mujeres a quienes se les practicó el exudado vaginal durante el estudio, se encontró que 138 de ellas (34,2 %) tuvieron crecimiento de hongos levaduriformes en el medio de agar Sabouraud cloranfenicol; de estos, 123 fueron identificados como especies de Candida (89,1 %). Las especies más frecuentemente aisladas fueron: C. albicans (54,5 %), seguida de C. glabrata (19,5 %) y C. lusitaniae (8,1 %). En la categoría colonización se agruparon 60 de estos (48,8 %) y en la categoría infección se registró un total de 63 aislamientos (51,2 %).

En la tabla 1 se muestra la distribución de los valores de CMI frente a clotrimazol de los aislamientos de Candida agrupados por especies y en las categorías ya mencionadas. De manera general, 44 aislamientos en la categoría colonización (73,3 %) y 49 en la categoría infección (77,7 %) mostraron un valor de CMI £ 0,125 mg/mL; sin embargo, 2 aislamientos de C. glabrata (uno de cada categoría) alcanzaron los valores más altos de CMI (16 mg/mL).

Tabla 1. Distribución de los valores de CMI (mg/mL) de clotrimazol en las especies de Candida, según las categorías de colonización e infección

Categoría colonización

Categoría infección

En la tabla 2 se resumen los valores de las MG y rangos de CMI de clotrimazol, así como, las CMI50 y CMI90 de los aislamientos de las diferentes especies de Candida. En el total de los aislamientos de las categorías colonización e infección se observaron valores semejantes en las medias geométricas de CMI (0,23 µg/mL y 0,22 µg/mL, respectivamente), rango (£ 0,125 - 16 µg/mL) y CMI50 (£ 0,125 µg/mL); sin embargo, la CMI90 en la categoría infección (2 µg/mL) es mayor que en colonización (1 µg/mL). Los aislamientos de C. glabrata mostraron los valores de CMI más elevados en ambas categorías y el rango más amplio entre todas las especies. C. parapsilosis también tuvo una CMI90 de 2 µg/mL en la categoría infección. Los valores más bajos de la MG y rangos fueron encontrados en C. lusitaniae, C. krusei, C. kefyr y las 4 cepas de Candida spp. Las cepas de C. albicans y C. tropicalis mostraron valores de medias, rangos, CMI50 y CMI90, iguales en ambas categorías. No hubo diferencia estadísticamente significativa entre los valores de CMI de las diferentes especies agrupadas en las categorías colonización e infección.

Tabla 2. Distribución de los resultados de las medias geométricas (MG), rangos, CMI50 y CMI90 (µg/mL) de clotrimazol en las especies de Candida aisladas

La distribución de los valores de CMI frente a nistatina se muestran en la tabla 3 donde en general, estos son más elevados en casi todas las especies en relación con clotrimazol; así, 36 % de las cepas de C. albicans en la categoría de colonización y 44 % en la categoría de infección mostraron una CMI de 1 µg/mL, lo que también se observa en C. lusitaniae (60 %) y C. parapsilosis (66,6 %) en la categoría infección; sin embargo, en estas 2 especies en la categoría colonización los valores de CMI son iguales o superiores a 1 µg/mL. En C. glabrata los valores están distribuidos de 0,25 a 2 µg/mL en la categoría colonización, mientras que en la categoría infección alcanzan 16 µg/mL.

Tabla 3. Distribución de los valores de CMI (mg/mL) de nistatina en las especies de Candida, según las categorías de colonización e infección

Categoría colonización

Con respecto a la nistatina (tabla 4), se registraron valores de medias y rangos mayores en la categoría infección en los aislamientos de C. albicans, C. parapsilosis y C. tropicalis; en cambio, C. glabrata, C. lusitaniae y Candida spp. tuvieron medias geométricas superiores en la categoría colonización. Con respecto a la CMI50 y la CMI90, estas fueron iguales en ambas categorías para C. albicans, C. tropicalis, y Candida spp; solo C. lusitaniae tuvo valores menores en infección y C. parapsilosis que tuvo el mayor valor de CMI90 en infección. Los valores más elevados de MG se registraron en C. lusitaniae y Candida spp. en colonización y C. parapsilosis en ambas categorías; el rango más amplio y elevado se registró en C. glabrata. Solo se encontró diferencia significativa (p £ 0,01) entre las MG de ambas categorías en los aislamientos de C. lusitaniae (3,19 y 0,75 mg/mL).

Tabla 4. Distribución de los resultados de las medias geométricas (MG), rangos, CMI50 y CMI90 (µg/mL) de nistatina en las especies de Candida aisladas

Al analizar la relación entre la aplicación de terapia con antifúngicos tópicos y antibacterianos orales en episodios previos de infección vaginal, en relación con el resultado de los valores de CMI de los aislamientos obtenidos frente a clotrimazol (tabla 5), se encontró, que 27 aislamientos procedían de mujeres tratadas con clotrimazol, 26 con nistatina más clotrimazol, 23 con nistatina y 18 con antibacterianos; la MG fue ligeramente más elevada en la categoría infección en los aislamientos pertenecientes a las mujeres que se habían tratado con antimicóticos. No hubo significación estadística entre las categorías de aislamiento y la aplicación o no de tratamiento previo.

Tabla 5. Relación de las CMI (µg/mL) de clotrimazol en aislamientos vaginales de Candida, procedentes de pacientes con tratamientos previos en episodios anteriores de infección vaginal

n: número de aislamientos obtenidos de pacientes previamente tratadas.
MG: media geométrica de las concentraciones inhibitorias mínimas.

Analizando la misma relación con respecto a nistatina (tabla 6) se registraron los valores más elevados de la MG (1,53 µg/mL) en la categoría infección en los aislamientos de las mujeres que recibieron terapia previa con clotrimazol y en la categoría colonización la media más elevada fue de 0,89 µg/mL en los correspondientes a las mujeres que recibieron nistatina. Se observó que, en general, las MG fueron más elevadas que las registradas en el ensayo con clotrimazol. No hubo diferencia estadísticamente significativa al comparar las categorías de los aislamientos con la aplicación previa de algún tratamiento.

Tabla 6. Relación de las CMI (µg/mL) de nistatina en aislamientos vaginales de Candida, procedentes de pacientes con tratamientos previos en episodios anteriores de infección vaginal

n: número de aislamientos obtenidos de pacientes previamente tratadas.
MG: media geométrica de las concentraciones inhibitorias mínimas.

En relación con la la aplicación de tratamientos previos con antimicóticos, datos registrados en la encuesta confirman que en 76 de los 123 aislamientos de Candida (61,7 %) las mujeres habían utilizado algún tratamiento con antifúngico en episodios anteriores de candidiasis y muchos (46,3 %) ocurrieron en un lapso menor de 1 año antes de la consulta; de las pacientes que se aplicaron tratamiento, 40 aislamientos correspondían a la categoría infección (52,6 %) y 36 a colonización (47,4 %). En ambas categorías predominó la aplicación del tratamiento individual (sin incluir a la pareja).

Discusión

Hasta la fecha el clotrimazol ha sido utilizado como agente de referencia para evaluar antimicóticos de nuevas generaciones y esquemas de tratamiento con azoles en mujeres con candidiasis vaginal. Aunque se han realizado algunos estudios para determinar las CMI de clotrimazol en levaduras,14-18 no se encontró ninguno que relacionara el número de colonias aisladas en cultivo primario con los resultados de las CMI.

Aún cuando para clotrimazol no se han establecido valores de corte que indiquen sensibilidad o resistencia, llaman la atención los valores elevados de CMI de C. glabrata en ambas categorías, si se toma en cuenta que este antifúngico se ha empleado ampliamente en el tratamiento de la candidiasis vulvovaginal, y que por otra parte, la frecuencia de aparición de esta especie ha ido en aumento desde hace alrededor de 10 años.19
]]> Los resultados de la determinación de las CMI de clotrimazol muestran valores más elevados en las MG, el rango, la CMI50 y la CMI90 de C. albicans, C. glabrata, C. parapsilosis y C. krusei en comparación con los registrados por Torres-Rodríguez y otros,15 quienes utilizaron la metodología del NCCLS en una serie de 124 aislamientos y obtuvieron un rango entre 0,03 y 2 mg/mL para estas especies. Asimismo, las CMI50 y CMI90 son mayores que las publicadas por Lynch y Sobell14 en 2 series de 177 y 200 aislamientos, utilizando una técnica de macrodilución en caldo Yeast Nitrogen Base (YNB), cuyo valor fue de 0,01 a 0,02 mg/mL para las mismas especies excepto, C. glabrata que osciló entre 0,01 y 0,78 mg/mL. Los aislamientos de C. lusitaniae también muestran valores de la CMI50 y CMI90 mayores que los de ese mismo estudio. En otro trabajo sobre las CMI de clotrimazol en 26 cepas de diferentes especies de Candida, utilizando el caldo YNB se obtuvo un rango de 0,062-8 mg/mL,16 valor un poco más bajo que el rango para el total de los aislamientos cubanos; sin embargo, Hussain y otros encontraron valores de CMI en medio YNB iguales a los encontrados aquí (16 mg/mL) para C. glabrata y valores más elevados para C. albicans, C. lusitaniae, C. tropicalis, C. parapsilosis y C. krusei.18

Es interesante observar que la mayoría de los rangos de CMI frente a nistatina de las diferentes especies de Candida son mayores que los de las mismas especies frente al clotrimazol. Algunas investigaciones revelan que cuando las cepas son expuestas repetidamente a nistatina in vitro, estas tienden a incrementar el valor de la CMI.1 Por otra parte, también se ha comunicado el antagonismo entre azoles y anfotericina B, que tal vez podría ser extensivo a nistatina la cual pertenece al mismo grupo de antifúngicos.4,5 Este razonamiento podría sustentarse en que algunas de las mujeres notificaron usar un óvulo de nistatina o clotrimazol como tratamiento preventivo al concluir la menstruación porque declararon padecer episodios frecuentes de candidiasis vulvovaginal y, probablemente, esta puede ser una práctica muy extendida en la población.

Los valores de las medias geométricas, rango, CMI50 y CMI90 de nistatina son menores que los reportados por Fernández Andreu y otros, aunque el rango obtenido en su estudio fue más estrecho pero su límite superior fue de 8 mg/mL, mientras que en el presente estudio fue de 16 mg/mL.10 El rango para las mismas especies en una investigación llevada a cabo por Haller y Plempel16 también es igual o menor, en contraste, Hussain y otros18 comunican rangos más elevados para todas las especies, excepto para C. glabrata.

Al observar que los valores de las medias y rangos de las CMI de nistatina son más elevados que los obtenidos para clotrimazol, en general, resalta una CMI de 16,0 mg/mL entre los aislamientos de mujeres que usaron previamente clotrimazol o nistatina + clotrimazol, pertenecientes a la especie C. glabrata, en concordancia con lo expuesto antes por otros autores.14,15,19 También podría pensarse en la resistencia cruzada entre compuestos azólicos ya descrita en esta especie,19 o que dosis acumulativas de estos mismos compuestos estén favoreciendo la aparición de especies de Candida con CMI elevadas y es probable que difíciles de tratar clínicamente, como también se ha comprobado en cepas causantes de candidiasis orofaríngea.20

Este constituye el primer estudio realizado en Cuba para determinar la sensibilidad al clotrimazol y el segundo frente a la nistatina en aislamientos vaginales de Candida. Los resultados sugieren la necesidad de mantener una vigilancia que permita detectar la aparición de cepas resistentes causantes de fallos terapéuticos o recidivas.

Agradecimientos

A la doctora Caridad Almanza y al personal del Laboratorio de Microbiología del Hospital Ginecoobstétrico "Ramón González Coro" y del Laboratorio de Micología del Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí", en Ciudad de La Habana, por toda la colaboración y el apoyo brindado para la realización de este trabajo.

Summary

Subject headings: MICROBIAL SENSITIVITY TESTS/ methods; CANDIDA; CLOTRIMAZOLE; NYSTATIN; IN VITRO.

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Recibido: 2 de junio de 2003. Aprobado: 17 de julio de 2003.
Dra. Vilma Llovera Suárez. Dra. Vilma Llovera Suárez. Universidad de Carabobo Núcleo Aragua, Av. Ruiz Pineda, Barrio La Morita II, Maracay, Estado Aragua, Venezuela. Correo electrónico: ciipk@ipk.sld.cu; federicollovera@cantv.net.ve

1 Profesora Agregada. Universidad de Carabobo Núcleo Aragua, Venezuela.
2 Investigador Auxiliar. Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí"