Se evaluó la capacidad infectiva de promastigotes de Leishmaniaamazonensis al ser tratados con una serie de 10 derivados de la tiadiazina. Los parásitos fueron incubados durante 24 h con 1 o 0,1 mg/mL de cada compuesto y posteriormente, se infectaron macrófagos peritoneales de ratones BALB/c en cultivos. Todos los compuestos causaron una reducción de la capacidad infectiva de los parásitos mayor que 50 %. El producto T1O fue el que causó un mayor efecto, disminuyendo la infección en 92,8 % de infección.
Leishmania es un protozoo parásito que causa la enfermedad conocida como leishmaniosis, la cual tiene un amplio rango de manifestaciones clínicas que van desde lesiones cutáneas hasta la enfermedad visceral. El tratamiento convencional consiste en el uso de antimonios pentavalentes, anfotericina B o pentamidina. Sin embargo, estos medicamentos causan una alta toxicidad, son muy costosos, no son eficaces en todos los casos y se ha reportado la aparición de cepas resistentes; lo que ha provocado que actualmente sea imprescindible el desarrollo de nuevos fármacos para el tratamiento de esta parasitosis.1
En trabajos previos, se demostró la actividad antileishmanial de derivados de la tetrahidro-2H-1,3,5-tiadiazina-2-tiona disustituida frente a amastigotes intracelulares de Leishmania amazonensis.2 Estos compuestos fueron diseñados con el objetivo de inhibir proteasas del tipo cisteíno (CPs) presentes en el parásito.
Las CPs tienen un papel crucial para la supervivencia e infectividad de los parásitos en el hospedero humano. Estas proteinasas están implicadas en un gran número de procesos como son la transformación de una forma parasitaria en la otra, la nutrición del parásito, la invasión de macrófagos del hospedero, así como en la evasión de los mecanismos del sistema inmune.3 Todos estos aspectos han conllevado a considerar estas enzimas como un atractivo blanco para el desarrollo de agentes terapéuticos contra esta parasitosis.4
En este estudio, sus autores se propusieron determinar el efecto que producen 10 derivados de la tiadiazina sobre la capacidad infectiva in vitro de promastigotes de Leishmania amazonensis.
Se evaluaron 10 derivados de la tetrahidro-2H-1,3,5-tiadiazina-2-tiona disustituida (tabla 1, fig. 1), diseñados y sintetizados en la Facultad de Química de la Universidad de La Habana, Cuba. La síntesis se realizó como se ha descrito previamente, y la pureza de los compuestos fue verificada por RMN utilizando H1 y C13.2
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Tabla 1. Composición química de los derivados de la tiadiazina
Compuesto
R (sustituyente en la posición 5)
T1B
-(CH2)2-COOH
T1C
-(CH2)5-COOH
T1D
-CH(CH3)-COOH
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T1H
-CH(CH2-C6H6)-COOH
T1I
-CH(CH2-CONH2)-COOH
T1L
-CH[(CH2)2-S-CH3]-COOH
T1M
-CH2-CO-NH-CH2-COOH
T1A
-Ch2-COOH
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T1K
-CH[(CH2)2-COOH)]-COOH
T1O
-CH[(CH2)2-CONH2]-COOH
Fig.1. Estructrura química general de la tiadiazina.
Se utilizó la cepa de Leishmania amazonensis (MHOM/77/LTB0016), donada por el Departamento de Inmunología de la Fundación Oswaldo Cruz, Fiocruz, Río de Janeiro, Brasil.
Los promastigotes se mantuvieron en medio de Schneider (SIGMA, St. Louis, MO, USA), suplementado con antibióticos (penicilina sódica 200 UI, estreptomicina 200 µg/mL) y suero fetal bovino (SIGMA, St. Louis, MO, USA), descomplementado con calor (56 ºC, 30 min). Los parásitos utilizados en todos los experimentos no excedieron el décimo pase en medio de cultivo.
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Se determinó la capacidad infectiva de promastigotes de L. amazonensis. Un cultivo en fase logarítmica de crecimiento fue ajustado a 105 parásitos/mL y se distribuyeron 999 mL en tubos plásticos de 15 mL. A la suspensión se le añadió 1 mL de la droga diluida en dimetilsulfóxido (DMSO), quedando a una concentración final de 1 mg/mL para los compuestos T1B, T1C, T1D, T1H, T1I y T1M; mientras que T1A, T1K y T1O quedaron a una concentración final de 0,1 mg/mL.
Los cultivos se incubaron a 26 ºC y 24 h después se centrifugó a 840 g durante 10 min, se eliminó el sobrenadante, se añadió 1 mL de medio Schneider fresco y se incubó bajo las mismas condiciones. Cuando los parásitos llegaron al inicio de la fase estacionaria de crecimiento (5to d), fueron utilizados para infectar macrófagos peritoneales de ratones BALB/c.
Los macrófagos fueron extraídos mediante lavados con RPMI (SIGMA, St. Louis, MO, USA) suplementado con antibióticos (penicilina sódica 200 UI, estreptomicina 200 µg/mL). La suspensión celular (1-3 x 106 células/mL) se distribuyó en placas de 24 pozos (Costarâ, USA) incubándose a 37 ºC en una atmósfera de CO2 5 %. Después de 2 h, la monocapa fue lavada con solución salina estéril (SSE) y los macrófagos fueron infectados con promastigotes de L. amazonensis a una proporción de 4 parásitos por célula. Los cultivos se incubaron a 37 ºC y 5 % de CO2. Después de 4 h se eliminaron los parásitos libres mediante lavados con SSE y se añadió 1 mL de medio RPMI 10 % de suero fetal bovino y antibióticos a las concentraciones correspondientes, incubando nuevamente bajo las mismas condiciones.5 Después, a las 24 h, la monocapa fue fijada con metanol y teñida con Giemsa. El porcentaje de infección y el número de amastigotes por célula fue determinado mediante el análisis de 100 macrófagos en un microscopio óptico con lente de inmersión (100x). Se calculó el porcentaje de infectividad de los promastigotes (% ID) mediante la fórmula: porcentaje de Infectividad (% ID)= (capacidad infectiva de promastigotes tratados/capacidad infectiva de promastigotes controles) x 100; donde la capacidad infectiva fue determinada por la multiplicación del promedio del número de amastigotes por macrófago y el porcentaje de macrófagos infectados. En cada experimento se incluyó un grupo control, donde los promastigotes fueron tratados con 1 mL de DMSO durante 24 h. Todos los cultivos se realizaron en duplicado y se hicieron 3 réplicas del experimento para cada producto.
El % ID fue comparado por el test de Kruskal-Wallis utilizando el programa STATISTICA para Windows.
El tratamiento de los promastigotes con los derivados de la tiadiazina durante 24 h a una concentración de 1 mg/mL provocó una reducción en el número de parásitos 5 d después del tratamiento con respecto al control; siendo superior para los cultivos tratados con los productos T1A, T1K y T1O, en los que apenas se observaron promastigotes móviles para la posterior infección experimental de macrófagos murinos. Por tal motivo, la capacidad infectiva de promastigotes tratados con estos 3 compuestos fue evaluada después de un tratamiento a 0,1 mg/mL, una concentración 10 veces inferior a la utilizada para el resto de la serie.
Todos los compuestos provocaron un marcado efecto inhibitorio de la infectividad de los promastigotes, teniendo en cuenta que la infección no superó 50 %, al analizar tanto el porcentaje de macrófagos infectados, así como el número de amastigotes por macrófago. En la tabla 2 puede observarse que en los parásitos tratados a una concentración de 1 mg/mL, el compuesto T1D fue el que mostró menor porcentaje de infectividad, siendo estadísticamente diferente (p< 0,05) de los tratados con los otros productos.
Tabla 2. Reducción de la capacidad infectiva de promastigotes de L. amazonensis tratados con derivados de la tiadiazina durante 24 h
Compuesto
Concentración de los derivados
Porcentaje de macrófagos infectados
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Número de amastigotes por macrófago
Porcentaje de Infectividad
(%ID)
T1B
1 mg/mL
61,00
3,15
18,11
T1C
49,00
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1,97
9,10
T1D
17,00
1,98
3,16
T1H
86,67
3,97
32,38
]]>
T1I
85,00
5,83
46,70
T1L
45,36
2,15
9,19
T1M
51,00
]]>
2,27
10,89
T1A
0,1 mg/mL
81,00
3,69
28,17
T1K
52,00
2,97
]]>
14,55
T1O
40,00
2,07
7,80
Controles (promastigotes tratados con 1 mL de DMSO)
96,00
11,05
100
Entre los promastigotes que se expusieron a concentraciones de 0,1 mg/mL, los incubados con el producto T1O provocaron menor infección, siendo estadísticamente significativa (p< 0,05) en relación con el resto de los productos evaluados. En la figura 2 se muestran las diferencias apreciables entre el número de amastigotes residentes en los macrófagos de los cultivos controles y aquellos tratados con el compuesto T1O a 0,1 mg/mL durante 24 h.
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Fig. 2. Macrófagos que fueron infectados con promastigotes de L. amazonensis, fijados y teñidos con Giemsa. A: cultivo control; B: cultivo infectado con promastigotes previamente tratados durante 24 h con 0,1 mg/mL del producto T10.
El desarrollo de drogas contra Leishmania ha estado encaminado a la identificación de candidatos potenciales que actúen sobre vías metabólicas esenciales del parásito y que no estén presentes en el hospedero mamífero. Por otra parte, la virulencia del parásito constituye un blanco atractivo; porque su atenuación pudiera reducir la severidad de la enfermedad. Esto facilitaría al sistema inmune del hospedero desarrollar una respuesta protectora, que de manera sinérgica con el tratamiento, conlleve a la cura del paciente.6
En la literatura se ha reportado la evaluación de varios inhibidores de CPs contra Leishmania. Selzer y otros reportaron la actividad inhibidora de derivados de la hidracina frente a promastigotes de L. major tratados durante 24 h. En el análisis de los parásitos por microscopia electrónica, se observó una dilatación anormal del lisosoma y del paquete flagelar del parásito, lugar donde ocurre la endocitosis y la exocitosis, y fue demostrado además, por estudios inmunohistoquímicos con anticuerpos específicos, que en estos organelos hay una alta concentración de CPs. Además, los autores demostraron que estos inhibidores fueron efectivos frente a la catepsina B tipo cpB y la catepsina L tipo cpL en ensayos de actividad enzimática.7
Hilaire y otros, en el 2002, demostraron que promastigotes de L. braziliensis tratados durante 50 min con diferentes concentraciones de inhibidores peptídicos de las cpB, disminuyeron su capacidad de infectar macrófagos peritoneales de ratones BALB/c; observando tanto una reducción en el número de macrófagos infectados, como en el número de amastigotes por macrófago. Estos ejemplos han brindado una prueba de que al tratar promastigotes con inhibidores de las CPs resulta en una menor infección de la célula hospedera por Leishmania.4 Resultados similares fueron obtenidos por Mottram y otros con anterioridad, empleando parásitos genéticamente manipulados, desprovistos de genes que codifican para las CPs.8
La adhesión del promastigote a la membrana del macrófago ocurre mediante un mecanismo de unión entre un ligando y un receptor, lo cual constituye un pre-requisito para que se realice de manera satisfactoria la fagocitosis.9 Sin embargo, en los casos previamente citados, la ineficiente infección de los macrófagos parece estar asociada con la diferenciación de las formas metacíclicas a amastigotes y no con la habilidad del parásito de invadir e infectar células.5,8
La baja infectividad de los promastigotes de L. amazonensis después de ser tratados con los derivados de la tiadiazina, podría sugerir que estos compuestos intervienen en el proceso de fagocitosis por la inducción de alteraciones en algún ligando de la membrana del parásito o por inhibición de las proteinasas que intervienen en la transformación del estadio extracelular (promastigote) en intracelular (amastigote), como pudieran ser las CPs. Leishmania expresa altos niveles de diferentes clases de CPs. Uno de los grupos de mayor interés está constituido por las cpB, las cuales están representadas por 19 copias en el genoma que expresan subsecuentemente diferentes isoenzimas.4,10
Aunque todos los compuestos evaluados en este trabajo, disminuyeron la capacidad infectiva de los promastigotes, el producto T1O fue el que provocó una mayor reducción. En previos estudios se observó que este derivado tuvo una mayor actividad frente a amastigotes intracelulares de la misma especie, así como cuando se trató los macrófagos antes de ser infectados con los promastigotes.3 Todo lo anterior expuesto le atribuye una mayor importancia al producto T1O. El desarrollo de experimentos bioquímicos y moleculares con el fin de estudiar los daños que causa en los promastigotes el tratamiento con los derivados evaluados, permitiría dilucidar el posible mecanismo de acción de estos compuestos.
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Effects of thiadiazine derivatives on the infective capacity of Leishamia amazonensis promastigotes
Summary
The infective capacity of Leishmania amazonensis promastigotes was evaluated after they were treated with a series of 10 thiadiazine derivatives. The parasites were incubated for 24 hours with 1 or 0,1 mg/ml of each compound and then, peritoneal macrophages from BALB/c mice were infected in cultures. All the compounds managed to reduce the infective capacity of parasites by more than 50%. T10 product exhibited the highest effect since it reduced infection by 92,8%.
2. Monzote L,Montalvo AM, Fonseca G, Pérez R, Suárez M, Rodríguez H. In vitro activities of thiadiazine derivatives against Leishmania amazonensis. Drug Research 2005;55:232-8.
3. Coombs GH, Mottram JC. Proteinases of Trypanosomes and Leishmania. En: Trypanosomiasis and Leishmaniasis. Biology and Control. Hide G, Mottram JC, Coombs GH, Holmes PH, ed. U.K :CAB international:Oxon; 1997. p.177-97.
4. Hilaire PM, Alves LC, Herrera F, Renil M, Sanderson SJ, Mottram JC, et al. Solid-phase library synthesis, screening and selection of tight-binding reduced peptide bond inhibitors of a recombinant Leishmania mexicana cysteine proteinase B J Med Chem 2002;45:1971-82.
5. Caio TSE, Lima MD, Kaplan MAC, Nazareth MM, Rossi-Bergmann B. Selective effect of 2’,6’-dihydroxy-4’methoxychalcone isolated from Piper aduncum on Leishmania amazonensis. Antimicrob Agents Chemother 1999;43:1234-41.
6. Davis AJ, Murray HW, Handman E. Drugs against leishmaniasis: a synergy of technology and partnerships. Trends Parasitol 2004;20:73-6.
7. Selzer P, Pingel S, Hsieh I, Ugele B, Chan V, Engel JC, et al. Cysteine protease inhibitors as chemotherapy: Lessons from a parasite target. Proc Natl Acad Sci 1999;96:1115-22.
8. Mottram JC, Souza AE, Hutchison JE, Carter R, Frame MJ, Coombs GH. Evidence from disruption of the Lmcpb gene array of Leishmania mexicana that cysteine proteinases are virulence factors. Proc Natl Acad Sci 1996;93:6008-13.
9. Temporal RM, Cysne-Finkelstein L, Echevarria A, De Souza MAS, Sertã M, da Silva-GonValves AJ. et al. Effects of amidine derivatives on parasite-macrophage interaction and evaluation of toxicity. Drug Research 2002;52:489-93.
10. Mottram JC, Frame MJ, Brooks DR, Terley L, Hutchison JE, Souza AE, et al. The multiple cpB cysteine proteinase genes of Leishmania mexicana encode isoenzymes that differ in their state regulation and substrate preferences. J Biol Chem 1997;272:14285-93.
Recibido: 3 de noviembre de 2004. Aprobado: 10 de noviembre de 2005. Lic. LianetMonzote Hidalgo. Instituto de Medicina Tropical “Pedro Kourí”. Apartado 601, Marianao 13, Ciudad de la Habana, Cuba; Tel: 53 7 2020650; Correo electrónico: monzote@ipk.sld.cu
