Lic. María Magdalena Rodríguez,1 Lic. Juan A. Bisset,2 Dra. Omayda Pérez,3 Téc. Francisco Ramos4 y Dra. Grisel E. Risco5
Se realizó el estudio sobre el modo de herencia de la resistencia al insecticida organofosforado temefos, a partir de una cepa de Aedes aegypti de referencia (SAN-F6), resistente, con un valor de factor de resistencia de 200x, comparado con la cepa de Aedes aegypti susceptible a insecticidas (ROCKEFELLER). Se llevaron a cabo cruces genéticos entre la cepa resistente y la susceptible a temefos, obteniéndose una F1 (cruce). Las hembras de esta F1 del cruzamiento se cruzaron con machos de la cepa ROCKEFELLER (retrocruce) y como resultado se obtuvo que la resistencia a temefos se heredó de forma semidominante, mediada por un solo factor. La actividad de Est-A4, observada en la electroforesis en gel de poliacrilamida y medida mediante ensayos bioquímicos, fue mayor en la cepa resistente a temefos (SAN-F6), menor en la cepa susceptible (ROCKEFELLER) e intermedia en el cruce de estas 2 cepas. Un menor efecto del parental resistente fue observado en el retrocruce tanto en la mortalidad con temefos, como en la actividad de la Est. A4. Estos resultados sugieren que la actividad de esterasas pudiera heredarse también, al igual que la resistencia a temefos, como un carácter semidominante.
Palabras clave: Aedes aegypti, resistencia, modo de herencia, temefos, esterasa, y glutation transferasa.
El mosquito urbano Aedes aegypti (L.) (Díptera: Culicidae) transmite la fiebre amarilla, el dengue y la fiebre hemorrágica del dengue (FDH) en muchos países tropicales. Estas patologías causan grandes impactos en la salud pública y están distribuidas en áreas de Asia, el Pacífico, África, América Latina y el Caribe.1
Hasta el momento no hay una solución para controlar el dengue/FDH y todavía no se dispone de una vacuna tetravalente efectiva y segura contra esta enfermedad, por lo que el control del vector continúa siendo la única opción para prevenir o reducir su transmisión. El control de Aedes aegypti se lleva a cabo a través de la participación de la comunidad en la eliminación de los criaderos del vector; sin embargo, solo estas acciones de la comunidad no son suficientes En Cuba, el insecticida organofosforado temefos (1 % granulado) es de manera rutinaria aplicado directo en los criaderos para el control larval, y para el control de adultos se utilizan sobre todo piretroides en caso de epidemia o en períodos de alta prevalencia del vector.
Ya existen reportes de resistencia a temefos en Cuba2,3 y previamente se había reportado que las enzimas esterasas desempeñan un papel importante en la resistencia a este insecticida.4 En Aedes aegypti de Venezuela se demostró que la resistencia a temefos se hereda de forma monofactorial.5 Este estudio fue llevado a cabo para determinar el modo de herencia de la resistencia a temefos en Aedes aegypti de Cuba, así como analizar la variación de la frecuencia de los mecanismos de elevada actividad de esterasas glutation transferasa en los cruces genéticos.
Cepas de Aedes aegypti a utilizar:
ROCKEFELLER: cepa susceptible de referencia, suministrada por CDC, de San Juan, Puerto Rico.
]]> SANTIAGO DE CUBA: una cepa de Aedes aegypti colectada en Santiago de Cuba (Cuba) en 1997.SAN-F6: una cepa de Aedes aegypti seleccionada con temefos a 90 % de mortalidad por 6 generaciones consecutivas y con un nivel de resistencia a este insecticida de 200x.4
Herencia de la resistencia a temefos: 100 hembras de la cepa resistente a temefos (SAN-F6) fueron cruzadas con 100 machos de la cepa susceptible ROCKEFELLER. Fueron separadas 50 hembras resultantes de la F1 antes que se aparearan y se retrocruzaron con 50 machos de la cepa ROCKEFELLER para conocer el modo de herencia de la resistencia a temefos
Bioensayos en larvas: se determinó la resistencia a temefos mediante los bioensayos de la OMS, 1981,6 en la cepa susceptible ROCKEFELLER, la cepa resistente a temefos (SAN-F6) y en la generación resultante del cruce y retrocruce. Se realizaron 5 réplicas de cada concentración del insecticida (20 larvas por réplica), registrándose entre 2 y 98 % de mortalidad. Todas las soluciones se ajustaron a un volumen final de 1 mL con acetona. Esta concentración de acetona no causó mortalidad en los controles. La lectura de las mortalidades se realizó a las 24 h, hallándose la CL50 y la CL90 con el programa probit- log de Raymond, 1985.7
Ensayos bioquímicos:
La actividad de esterasas en larvas de tercer estadio tardío o cuarto temprano se determinó de acuerdo con el método estandarizado para Aedes aegypti.8 Se homogenizó cada larva en 200 mL de buffer fosfato 0,01 M, pH 7,5. En una placa de microtitulación de ELISA, a 20 mL del homogenato se le añadió 200 mL del sustrato (0,7-mM de b-naftil acetato). Después de dejar transcurrir la reacción por 10 min, se le añadió 40 mL de fast blue y se leyó la densidad óptica (DO) a 570 nm en lector de placas de ELISA Labsystems IMS, manufacturado en Finlandia.
La actividad de glutation transferasa (GST) fue determinada de acuerdo con el método de Booth y otros, 1961,9 y modificado para Aedes aegypti.8 A 20 mL de cada homogenato de larva se le añadió 250 mL de una mezcla de reacción de 1-cloro-2, 4 dinitrobenzeno 50 mM; y de glutation reducido 20 mM. Se dejó transcurrir la reacción por 3 min y se leyó la DO a 340 nm. Se calculó la actividad específica de GST, después de calcular la concentración de proteínas en cada homogenato y se expresó como mmol/mg.min.
Un estimado de la frecuencia de los mecanismos de esterasas y GST fue calculado a partir del número de individuos susceptibles para cada ensayo, asumiendo que la población se encontraba en equilibrio de Hardy-Weinberg.
Electroforesis: se realizó electroforesis en gel de poliacrilamida (10 %) para analizar la variación de la intensidad de las bandas de esterasa A4. En tubos Eppendorf (1,5 mL), se adicionaron 10 µL de muestra más 10 µL del indicador Xilene cianol (0,02 % en sacarosa 15 %). Se aplicaron 20 µL de esta mezcla en el gel y se realiza la corrida a 150 V, durante 45 min. Para la tinción de las bandas de esterasas, se sumergieron los geles en 50 mL de buffer fosfato (0,1 M) que contenía 4 mL de cada uno de los sustratos inespecíficos de las esterasas (y b-naftilacetato). Después se añadieron 0,5 g del colorante fast blue RR, disuelto previamente en agua destilada y SDS (duodecil sulfato de sodio) 5 %. Para fijar la coloración de las bandas se sumergió el gel en una solución de ácido acético 10 %. A cada una de las bandas se le determinó la movilidad relativa.
En la figura 1 se muestran los resultados del análisis probit de la línea de regresión, Log. de la dosis vs. % de mortalidad para la cepa susceptible (ROCKEFELLER), la cepa resistente a temefos (SAN-F6), la F1 resultante del cruce (ROCKEFELLER X SAN-F6), y para el retrocruce entre las hembras de la F1 resultantes del cuce y machos de ROCKEFELLER. La línea de la cepa heterocigótica RS (F1) está casi intermedia, pero más pegada a la línea de la cepa resistente (SAN-F6), que a la línea de la cepa susceptible (ROCKEFELLER). Estos resultados indican que la resistencia a temefos en Aedes aegypti de Cuba es heredada de forma semidominante.
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Fig 1. Probit-log realizado para las cepas de Aedes aegypti resistentes a temefos (SAN-F6), CRUCE, RETROCRUCE y la cepa susceptible de referencia ROCKEFELLER para el análisis del modo de herencia de la resistencia a temefos.
Para las larvas resultantes de los retrocruces (hembra F1 x macho de ROCKEFELLER), las líneas de dosis-mortalidad (d-m), presentan una inflexión aproximadamente en el valor correspondiente a 50 % de mortalidad, exhibiendo una meseta a partir de la concentración de temefos de 0,01 ppm. Esto indica que la resistencia a temefos fue monofactorial.
El examen visual de los geles reveló que la esterasa A4 con un valor de Rm de 0,7 se encontró amplificada excepto para la cepa susceptible ROCKEFELER (fig. 2). En esta misma figura se observó que la banda de Est- A4 fue más intensa en la cepa resistente SAN-F6 e intermedia en la F1 resultante del cruce de SAN-F6 y ROCK, para el retrocruce la intensidad de las bandas de Est. A4 fue muy baja.
Fig. 2. Patrones de esterasas observadas en electroforesis en gel de poliacrilamida en la cepa de referencia ROCKEFELLER (1), SAN-F6 (2,3,4,5), Cruce SAN-F6 x ROCKEFELLER (6,7) y retrocuce de
Se determinó la frecuencia en que se encontraba elevada la actividad de las enzimas esterasas y glutation transferasa en las cepas estudiadas. Como se observa en la figura 3, la frecuencia de esterasas en SAN-F6 es de 55 %, asociada con la resistencia a temefos, como ya fue demostrado en trabajos previos. Esta frecuencia tuvo un valor de 35,08 en la F1 resultante del cruce y muy baja resultó para el retrocruce (7,13). Estos resultados se relacionan muy bien con la variación de la resistencia a temefos mostrada en la figura 1.
Fig. 3. Frecuencia (%) de los mecanismos de resistencia de esterasas y glutation transferasa (GST), en las cepas parenteles (Rockefeller y SAN-F6) y en las cepas resultantes del cruce y retrocruce.
La frecuencia en que se encontró elevada la actividad de la GST fue igual que las esterasas con un valor de 55 % en SAN-F6. Sin embargo hubo una disminución de la frecuencia durante el cruce y retrocruce realizados, lo cual confirma aún más que esta enzima no está asociada con la resistencia a temefos y que las esterasas continúan siendo el principal mecanismo de resistencia a temefos en Aedes aegypti de Cuba.
Existen reportes de resistencia a temefos en cepas de Aedes aegypti colectadas en la región del Caribe.11-13 Esto se debe a que durante más de 20 años ha sido intenso su uso en esta región, aunque en muchas localidades ha sido utilizado solo ocasionalmente. En Venezuela observaron moderados niveles de resistencia a temefos en 2 cepas colectadas en las localidades de Coro y Maracay, con poca variación durante los años anteriores.14 En Cuba durante la epidemia de dengue de 2002 se reportó resistencia a temefos en 2 municipios con alta incidencia del vector, en Playa15 y en Guanabacoa.16 En este mismo año se reportó resistencia a temefos en un estudio realizado en 10 municipalidades de Río de Janeiro, Brazil,17 también se observó una disminución de la susceptibilidad a este insecticida en un estudio realizado desde 1992 hasta 2002 en 15 poblaciones de Aedes aegypti del norte y centro de Italia.18
En Cuba no se había realizado previamente ningún estudio sobre el modo de herencia de la resistencia a temefos en Aedes aegypti. En este trabajo se determinó que la resistencia a este insecticida se hereda de forma semidominante y monofactorial. Resultados similares obtuvieron Wirth y Georghiou, 1999,5 donde se determinó que la resistencia a temefos de Venezuela se heredaba en forma monofactorial. Sí se sabe que en Cuba la resistencia a malation en Culex quinquefasciatus se hereda de forma dominante y monofactorial.19
Desde 1984 se encontró una asociación entre el nivel de resistencia a temefos y el incremento en la actividad de esterasas en cepas de Aedes aegypti de Puerto Rico.20 Otros estudios también han demostrado que las esterasas desempeñan un papel importante en la resistencia a temefos,4,5,8,14,21,22 esta asociación fue demostrada mediante el uso de sinergistas y ensayos bioquímicos. En Cuba se demostró además esta asociación, por estudios de inhibición de la Est-A4 en gel de poliacrilamida.
El desarrollo de resistencia a temefos podría ser un serio problema en las operaciones de control de Aedes aegypti, y conociendo que esta resistencia se hereda de forma semidominante y monofactorial y que son las esterasas el factor responsable, se sugiere monitorear la frecuencia de este mecanismo de resistencia en poblaciones de Aedes aegypti que aparezcan en el campo, para crear estrategias de uso de este insecticida que permitan dilatar la aparición de resistencia.
A study on the mode of inheritance of temephos resistance was conducted using a temephos resistant Aedes aegypti reference strain (SAN-F6) with a value of resistance factor of 200x, compared with the insecticides susceptible Aedes aegypti strain (ROCKEFELLER). Genetic crossings were performed between temephos resistant and susceptible strains. An F1 crossing was attained. The females of this F1 crossing were crossed with males from the ROCKEFELLER strain (retrocrossing), and it was found that the temephos resistance was inherited in a semidominant way and as a monofactorial trait. The activity of Est-A4 observed in the polyacrylamide gel electrophoresis and measured by biochemical assays was higher in the strain resistant to temephos (SAN-F6), lower in the susceptible strain (ROCKEFELLER), and intermediate in the crossing of these two strains. A lower effect of the resistant parental strain was observed in the retrocrossing, both in the mortality with temephos and in the activity of Est. A4. These results suggest that the esterase activity may also be inherited, as well as the resistance to temephos, as a semidominant character.
Key words: Aedes aegypti, resistance, inheritance mode, temephos, esterase, and glutathione transferase.
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Recibido: 15 de julio de 2005. Aprobado: 26 de abril de 2006.
Lic. María Magdalena Rodríguez. Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí", AP 601, Marianao 13, Ciudad de La Habana, Cuba. Correo electrónico: mrodriguez@ipk.sld.cu
1 Licenciada en Bioquímica. Investigadora Auxiliar. Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí" (IPK).
2 Licenciado en Biología. Investigador Titular. IPK. ]]>
3 Médica Veterinaria. IPK.
4 Técnico en Química Analítica. IPK.
5 Especialista en Epidemiología. Centro Municipal de Higiene y Epidemiología de Guanabacoa.