ARTÍCULO ORIGINAL

Evaluación de la toxicidad de extractos de plantas cubanas con posible acción antiparasitaria utilizando larvas de Artemia salina L.

Evaluation of toxicity of Cuban plant extracts with possible antiparasitic action based on the use of Artemia salina larvae

Aymé Fernández-Calienes Valdés^I; Judith Mendiola Martínez^II; Lianet Monzote Fidalgo^III; Marley García Parra^IV; Idalia Sariego Ramos^V; Deyanira Acuña Rodríguez^VI; Ramón Scull Lizama^VII; Yamilet Gutiérrez Gaitén^VIII ]]> ^I Máster en Bioquímica. Investigadora Auxiliar. Departamento de Parasitología, Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí" (IPK). Ciudad de La Habana, Cuba.
^II Máster en Bioquímica. Investigadora Auxiliar. Instructora. IPK. Ciudad de La Habana, Cuba.
^III Máster en Farmacia. Investigadora Agregada. IPK. Ciudad de La Habana, Cuba.
^IV Máster en Parasitología. Aspirante a Investigador. IPK. Ciudad de La Habana, Cuba.
^V Máster en Parasitología. Investigadora Auxiliar. IPK. Ciudad de La Habana, Cuba.
^VI Técnica. IPK. Ciudad de La Habana, Cuba.
^VII Máster en Farmacia. Departamento de Farmacia, Instituto de Farmacia y Alimentos (IFAL). Ciudad de La Habana, Cuba.
^VIII Máster en Farmacia. IFAL. Ciudad de La Habana, Cuba.

Palabras clave: toxicidad, extractos de plantas, Artemia salina.

INTRODUCTION: Artemia salina lethality assay is considered a useful tool to determine preliminary toxicity of plant extracts. In our labs some plant species are studied because of their antiparasitic potentials.
OBJECTIVE: to evaluate A. salina nauplii mortality caused by ethanol extracts of Cuban medicinal plants.
METHODS: A. salina larvae were exposed to four concentrations of 35 ethanol extracts from 34 plant species, for 24 hours. Mean Lethal Concentration (LC₅₀) was determined to classify each extract into the categories of extremely toxic, highly toxic, mildly toxic or non toxic. ]]> RESULTS: out of the tested extracts, only 5 (Artemisia absinthium, Luffa cylindrica, Melia azedarach, Melaleuca leucadendron and Simarouba glauca) were classified as extremely or highly toxic, 13 as mildly toxic whereas 17 extracts (48,5 %) were non toxic exhibiting LC₅₀ values over 1 000 µg/mL.
CONCLUSIONS: most of the evaluated extracts showed low toxicity, which is a positive result. The five extremely toxic extracts will not be included in further studies.

Key words: toxicity, plant extracts, Artemia salina.

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INTRODUCCIÓN

Desde tiempos muy antiguos las plantas han sido utilizadas como medicinas. Varias especies de plantas han demostrado su potencial para proveer drogas efectivas contra enfermedades parasitarias, por lo que, muchos grupos de investigación se dedican a evaluar extractos vegetales como estrategia para hallar nuevas alternativas terapéuticas frente a estas afecciones.

Sin embargo, es bien conocido que muchas plantas pueden ocasionar reacciones tóxicas a quienes las utilizan.¹ Por esta razón, se llevan a cabo investigaciones con el propósito de determinar, además de la acción farmacológica, la toxicidad de las plantas medicinales.

La evaluación toxicológica preclínica se realiza rutinariamente en ratones. El elevado costo de estas pruebas así como el sufrimiento causado a los animales ha motivado el reemplazo de experimentos que utilicen animales de laboratorio, la reducción del número de animales usados en cada prueba o el perfeccionamiento de las metodologías existentes con el propósito de reducir el dolor y el estrés a los animales.²

El ensayo de letalidad de Artemia salina se basa en la posibilidad de causar la muerte de larvas de este crustáceo cultivadas en el laboratorio. Este método fue propuesto por Michael y otros,³ y posteriormente desarrollado por Vanhaecke y otros,⁴ así como Sleet y Brendel,⁵ con el propósito de contar con una herramienta útil y sencilla para la determinación de toxicidad. Este método, en el cual se determina el valor de la concentración letal media (CL₅₀) de compuestos y extractos en medio salino, ha sido utilizado para la detección de toxinas de hongos⁶ y cianobacterias,⁷ toxicidad de extractos de plantas,^8,9 metales pesados¹⁰ y para predecir citoxicidad de compuestos puros.¹¹ ]]> El presente estudio tuvo el propósito de realizar un primer tamizaje de la toxicidad mostrada por extractos de especies de plantas cubanas de interés medicinal, para valorar su inclusión en la evaluación posterior de la actividad antiparasitaria.

MÉTODOS

Colecta de las plantas y preparación de los extractos

Se colectaron partes de 34 especies de plantas, seleccionadas por su utilización como antiparasitarias después de la revisión de literatura etnobotánica. La colecta e identificación de las especies se realizó en el Jardín Botánico Nacional (JBN) por un especialista, en agosto de 2006. El código de entrada al jardín (numeración hecha por los especialistas del JBN) de los especímenes utilizados en el estudio fue registrado como referencia para colectas posteriores. La parte de la planta a evaluar se seleccionó de la información encontrada en la literatura respecto a la forma de utilización de la especie por la población. Cada órgano de la planta se colectó con cuidado para evitar la contaminación con otras partes o con materiales extraños. El material vegetal se secó en una incubadora con ventilación a 30 °C y después se pulverizó en partículas de aproximadamente 5 mm.

Se prepararon 35 extractos etanólicos. La extracción líquida del material seco procesado se realizó mediante la maceración durante 7 d en etanol 80 %. El solvente se eliminó por evaporación a presión reducida por 24 h y el residuo se mantuvo en congelación a - 70 °C al menos 48 h antes de su liofilización. ]]> De cada muestra liofilizada se prepararon soluciones concentradas de 50 mg/mL en dimetilsulfóxido (DMSO) 100 %. Estas soluciones se conservaron a 4 °C hasta su utilización.

Obtención de las larvas

Quistes de A. salina, donados gentilmente por especialistas del Centro de Investigaciones Pesqueras de Cuba, fueron puestos a eclosionar en un recipiente con agua de mar esterilizada, a temperatura ambiente durante 48 h bajo régimen continuo de luz. Después de la incubación, se colocó una fuente de luz a un lado del recipiente para atraer a las larvas y separarlas de los huevos aún sin eclosionar. Los crustáceos se colectaron y trasladaron a los pozos de la placa de ensayo utilizando una pipeta Pasteur. El número de larvas colectadas y añadidas a la placa se determinó utilizando un microscopio estereoscópico.

Ensayo de letalidad

]]> El ensayo consistió en exponer grupos de larvas a 4 concentraciones de extracto (1 000, 100, 10 y 1 µg/mL) durante 24 h a temperatura ambiente y bajo régimen continuo de luz. Primero, se prepararon placas de 24 pozos, se añadió a cada uno 1,5 mL de agua de mar suplementada con extracto de levadura (6 mg/mL) y con diluciones del extracto correspondiente. Seguidamente, se transfirieron entre 10 y 15 larvas a cada pozo.

Al finalizar las 24 h de exposición, se contó el número de organismos muertos y se calculó el porcentaje de mortalidad. Las larvas se consideraron muertas si no exhibían movimiento durante varios segundos de observación al microscopio estereoscópico. El experimento se consideró válido si el porcentaje de mortalidad en los controles (pozos preparados e incubados en las mismas condiciones pero en ausencia de extracto) no excedió de 10 %.

Cada concentración se evaluó por triplicado y cada extracto se ensayó 2 veces. La concentración letal media (CL₅₀) se calculó mediante interpolación lineal de los valores del porcentaje de mortalidad, para cada concentración, en cada experimento.

El grado de toxicidad del extracto se definió en función del rango en que se encontraron los valores de CL₅₀ de acuerdo con las categorías siguientes: extremadamente tóxico (CL₅₀< 10 µg/mL), muy tóxico (10< CL₅₀ <100), moderadamente tóxico (100< CL₅₀ <1 000) y no tóxico (CL₅₀> 1 000 µg/mL).¹²

RESULTADOS

En la tabla se muestran los valores de CL₅₀ para los 35 extractos evaluados. Los extractos más letales fueron los de A. absinthium, M. leucadendron, M. azedarach, S. glauca y L. cilindrica, que exhibiendo valores menores que 100 µg/mL. De los 30 extractos restantes, cuyos valores de CL₅₀ fueron mayores de 100 µg/mL, 17 (48,5 %) mostraron valores de CL₅₀ superiores a 1 000 µg/mL.

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Tabla. Especies de plantas medicinales cubanas incluidas en el estudio. Valores de concentración letal media (CL₅₀) y clasificación según la toxicidad mostrada frente a larvas de A. salina, de  extractos etanólicos de estas especies

sr: sin número de registro en el Jardín Botánico.

La clasificación de los extractos según su grado de toxicidad (tabla) evidencia que 85,7 % de los extractos evaluados se ubican en las categorías de menor toxicidad (moderadamente tóxico y no tóxico).

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DISCUSIÓN

La detección de extractos de plantas medicinales cubanas con acción antiparasitaria específica es el propósito final de las investigaciones. La fuerte acción citotóxica de un extracto vegetal o la demostración de toxicidad in vivo constituyen limitaciones relevantes para la búsqueda.

El ensayo de letalidad de larvas de A. salina ha sido utilizado con eficiencia para detectar componentes con acción citotóxica^11-14 y ha demostrado buena correlación al evaluar extractos de plantas con la toxicidad aguda oral en ratones.⁹ Estos hallazgos refuerzan la importancia de la utilización de este ensayo como prueba alternativa de toxicidad.

Con vistas a correlacionar la acción tóxica mostrada por extractos de plantas con otras actividades biológicas o con la presencia de determinados componentes químicos, varios autores reportan una clasificación de la toxicidad según el valor de la CL₅₀ del extracto. Aunque estas clasificaciones poseen variaciones entre sí, todas coinciden en agrupar los extractos con CL₅₀ inferiores a 100 µg/mL en las categorías de mayor toxicidad, mientras, los que muestran valores superiores a 1 000 µg/mL se clasifican como no tóxicos.^12,13,15 Este estudio reveló la presencia de 17 extractos no tóxicos y 5 extractos con elevada toxicidad (clasificados como muy tóxicos o extremadamente tóxicos).

A. absinthium es una especie utilizada como antiparasitaria y antipirética, tanto en Cuba¹ como en otros países.¹⁶ Su elevada toxicidad frente a larvas de A. salina ya había sido reportada por otros autores cubanos, al evaluar un extracto diferente de esta planta.⁹ El extracto del presente estudio se evaluó con anterioridad frente a un panel de protozoos y células humanas sin mostrar acción selectiva alguna.¹⁷

M. leucadendron es utilizada para combatir infecciones.^1,18 La acción antiprotozoaria y antifúngica de este extracto fue considerada inespecífica por causa de la citotoxicidad demostrada frente a células humanas.¹⁷

S. glauca pertenece a la familia Simaroubacea, caracterizada por la presencia de cuasinoides, cuya acción antimalárica,¹⁹ citotóxica¹⁹ y tóxica frente a larvas de A. salina^11,20 ha sido bien demostrada. El extracto del presente estudio no constituye una excepción al mostrar elevada toxicidad y citotoxicidad, lo cual hace del todo inespecífica su potente acción antiprotozoaria.¹⁷

Los extractos de M. azedarach y L. cylindrica no han sido evaluados previamente por su acción antiparasitaria o citotóxica. Sin embargo, es muy conocida la acción tóxica de la primera especie, en especial la ingestión de los frutos, por causa de la presencia de tetranortriterpenoides.^1,21 ]]> En general, los resultados del presente trabajo son favorables ante el hecho de que los extractos evaluados mostraron, mayoritariamente, baja toxicidad en este modelo. La elevada acción tóxica exhibida por los extractos de A. absinthium, M. leucadendron, S. glauca, M. azedarach y L. cylindrica hacen descartar la posibilidad de continuar estudios farmacológicos en esas especies.

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Recibido: 22 de junio de 2009.
Aprobado: 16 de julio de 2009.

Lic. Aymé Fernández-Calienes. Laboratorio de Malaria, Departamento de Parasitología, Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí". Autopista Novia del Mediodía Km 6 1/2. AP 601. Marianao 13. Ciudad de La Habana, Cuba. Teléf.: 53-7-202-0650. Correo electrónico: ayme@ipk.sld.cu ]]> 1 1974 2ª 2 1997 367-71 3 1956 123 464 4 1981 5 382-87 5 1983 7 435-46 6 1971 21 1011-6 7 1999 37 138-43 8 1991 383-409 9 2001 8 5 5 395-400 10 1998 172 315-25 11 1993 59 250-2 12 2003 16 36-45 13 1982 45 31-4 14 2000 72 395-402 15 1997 26 15-9 16 2002 80 75-83 17 2008 103 6 6 615-8 18 1999 22 447-53 19 2005 19 994-6 20 1997 41 1500-3 21 2008 46 10 10 1067-70