Actividad toxocaricida de plantas cubanas
Anti-Toxocara activity of Cuban plants
Idalia Sariego Ramos,I Adonis Pino Santos,II Ramón Scull Lizama,III Armando Cuéllar Cuéllar,III Aymé Fernández-Calienes Valdés,I Lázara Rojas RiveroI
I Instituto de Medicina Tropical “Pedro Kourí”. La Habana, Cuba.
II Clínica Veterinaria del Sur. Buenos Aires, Argentina. ]]>
III Instituto de Farmacia y Alimentos, Universidad de La Habana. La Habana, Cuba.
RESUMEN
Introducción: solo unos pocos medicamentos son efectivos contra los nematodos que migran por los tejidos, como es el caso de Toxocara canis, por lo que se hace necesario que se desarrollen nuevas opciones terapéuticas.
Objetivo: determinar el efecto in vitro de extractos de plantas medicinales cubanas contra larvas de T. canis.
Métodos: se prepararon extractos hidroalcohólicos de cinco especies de plantas y un extracto enriquecido en alcaloides, de Carica papaya. Todas las especies se han reportado en la medicina tradicional como antiparasitarias. La actividad antihelmíntica se determinó en placas de 96 pozos, mediante el cálculo de la movilidad relativa de las larvas, en tres intervalos de 24 h. Se incluyeron como referencia principios activos de medicamentos usados para el tratamiento de la toxocariasis. Se determinó la actividad citotóxica sobre células MRC-5 de los extractos activos contra las larvas; se usó un ensayo con bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio.
Resultados: el extracto hidroalcohólico de Argemone mexicana y el de C. papaya enriquecido en alcaloides, provocaron movilidades relativas por debajo del 80 % a las 72 h. Se utilizó como dosis 100 µg/mL, por lo que se consideraron activos contra el parásito. Ambos extractos no provocaron citotoxicidad sobre células MRC-5. Los extractos de Aloe vera, Artemisia vulgaris, Centrosema virginianum y Chenopodium ambrosioides no mostraron actividad contra el parásito.
Conclusión: se demostró la actividad potencial de los extractos de A. mexicana y C. papaya contra el parásito, lo que apoya la continuidad de los estudios fitoquímicos y farmacológicos.
Palabras clave: Toxocara canis, actividad antihelmíntica in vitro, plantas medicinales, Argemone mexicana, Carica papaya.
Introduction: only a few drugs are effective against nematodes moving through tissues like Toxocara canis, a fact that makes it necessary to develop new therapeutic options.
Objective: to determine the in vitro effect of Cuban medicinal plants extracts against Toxocara canis larvae.
Methods: hydroalcoholic extracts of five plant species and a Carica papaya alkaloid-enriched extract were prepared. All species have been informed by traditional medicine as antiparasitic. The anthelmintic activity was determined in 96 ponds, by calculating the larvae relative mobility, in three 24-hour intervals. Action principles of drugs used for treating toxocariasis were included as reference. They were included as reference used for the treatment of drug toxocariasis. The cytotoxic activity on MRC-5 cells was determined of the extracts active against the larvae. An assay with bromide 3-(4.5-dimethylthiazol-2-yl) -2.5-diphenyltetrazolium was used.
Results: the Argemone mexicana and Carica papaya alkaloid-enriched hydroalcoholic extracts provoked relative mobilities less than 80% after 72 hours. The dose used was of 100µg/ml, so they were considered active against the parasite. Neither of the extracts caused any cytotoxicity on MRC-5 cells. Aloe vera, Artemisia vulgaris, Centrosema virginianum and Chenopodium ambrosioides extracts did not show any activity against the parasite.
Conclusion: the potential activity of Argemone mexicana and Carica papaya extracts against the parasite was demonstrated, supporting the continuity of the phytochemical and pharmacological studies.
Keywords: Toxocara canis, in vitro anthelmintic activity, medicinal plants, Argemone Mexicana, Carica papaya.
]]> INTRODUCCIÓN
La toxocariasis humana es causada por la migración larval a través de órganos y tejidos, de dos especies de nematodos (Toxocara canis y Toxocara cati), cuyos hospederos definitivos son el perro y el gato domésticos.1 En el humano, la infección ocurre al ingerir de forma accidental huevos que han embrionado en el ambiente.2 Dentro del cuerpo humano, las larvas que emergen de los huevos, llegan a la circulación sistémica y se diseminan por tejidos y órganos, sin diferenciación, ni reproducción. La migración larval causa una reacción inflamatoria que puede matar a la larva, o forzarla a entrar en un estado hipobiótico, en el que puede sobrevivir durante años. Determinados estímulos pueden provocar la reactivación de la larva, que comenzará a migrar nuevamente.3
Aunque la toxocariasis humana puede transcurrir de manera asintomática, también pueden presentarse cuadros clínicos que van desde la toxocariasis encubierta, con síntomas y signos inespecíficos y de importancia menor, hasta síndromes más gravescomo el de larva migrans visceral, causado por la migración a través de órganos importantes como hígado y pulmones y el de larva migrans ocular, motivado por la migración a través de las estructuras de los ojos4 T. canis ha sido reportado en Cuba como la segunda especie de helminto que parasita canes callejeros y domésticos, y la contaminación del suelo con huevos embrionados del parásito, en parques y zonas públicas de La Habana.5-7 Reciente, se demostró que escolares de los municipios San Juan y Martínez y Fomento, de las provincias Pinar del Río y Sancti Spíritus, se encontraban muy expuestos al parásito.8
Los medicamentos usados para el tratamiento de la toxocariasis humana, se caracterizan por poseer poca solubilidad lo que ocasiona baja biodisponibilidad en los tejidos, lo que conlleva a la administración de dosis altas por periodos de tiempo prolongados.9 Además, se ha informado que en algunos pacientes el cuadro clínico no remite en su totalidad luego del tratamiento.10 Esto hace necesario que se desarrollen nuevas opciones terapéuticas.
Al tener en cuenta que numerosas plantas medicinales han sido usadas desde tiempos antiguos por el hombre, para tratar las helmintiasis, se considera este grupo de plantas como una posible fuente de nuevos compuestos que pudieran ser útiles para el tratamiento de la toxocariasis humana. En Cuba numerosas especies vegetales han sido usadas desde tiempos antiguos por la población para combatir los vermes.11 Esto unido al llamado realizado por el Ministerio de Salud Pública (MINSAP) de Cuba, para impulsar el estudio de la flora medicinal del país, motivó el desarrollo de la presente investigación, para evaluar el efecto de extractos de plantas medicinales cubanas contra larvas de T. canis. En el caso de Carica papaya, a diferencia del resto de las especies vegetales estudiadas, de las cuales se prepararon extractos hidroalcohólicos, se preparó un extracto enriquecido en alcaloides, pues estos ya han mostrado un efecto antiparasitario.12
MÉTODOS
Antihelmínticos
Se usaron como referencia albendazol (Chagzhou Yabang, China) y tiabendazol (Hikald Limited Company(LTD), China) y mebendazol (Parth Overseas, India), donados por el Laboratorio Farmacéutico “Reinaldo Gutiérrez”.
Parásitos
]]> Parásitos adultos de T. canisse colectaron de cachorros de Canis familiarisinfectadosde manera natural, a los que se les realizó eutanasia en el Centro de Control y Observación Canina del MINSAP, situado en La Lisa, La Habana. Los huevos se extrajeron del útero de las hembras adultas, mediante disección y se embrionaron en H2SO4 1M, a temperatura ambiente. Los huevos embrionados se incubaron durante 10 min, en una solución de hipoclorito de sodio al 5 %, que permitió disolver la cubierta externa. Luego de lavados sucesivos con solución salina tamponada con fosfatos, las larvas se liberaron mediante homogenización mecánica. Por último, las larvas se suspendieron en medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI(SIGMA))y se transfirieron a un aparato de Baermann en condiciones de esterilidad, para separarlas de huevos no embrionados u otros restos. Las larvas se mantuvieron en medio RPMI, suplementado con L-glutamina (2mM), a 37 °C, en atmósfera de CO2al 5 %, hasta su uso posterior.Selección de las plantas y preparación de los extractos
Se realizó una selección de plantas medicinales cuyo uso antiparasitario se encuentra recogido en un texto clásico de la etnobotánica en Cuba “Plantas medicinales, aromáticas o venenosas de Cuba”, escrito por Juan Tomás Roig.11 Las plantas se colectaron e identificaron por especialistas del Jardín Botánico Nacional y del Instituto de Ecología y Sistemática. Las especies de plantas colectadas, las partes usadas para obtener los extractos, el lugar de colecta, así como su número de entrada en herbarios reconocidos, se muestran en la tabla 1.
Para la preparación de los extractos hidroalcohólicos, las plantas se sometieron a un proceso de secado y pulverización y los extractos se obtuvieron por maceración, se utilizó etanol al 80 %, por 7 días. Transcurrido ese periodo de tiempo el solvente se evaporó y finalmente las soluciones se llevaron a sequedad mediante liofilización. En el caso de la Carica papaya se preparó un extracto enriquecido en alcaloides, para el cual el material seco y molido se maceró durante 21 días con metanol, luego se filtró y se concentró hasta la tercera parte de su volumen y se lavó con éter de petróleo. La fracción metanólica se concentró a sequedad y se añadió ácido sulfúrico al 1 %. La fracción ácida se lavó con cloroformo y la fracción clorofórmica se concentró.13 Para los ensayos se preparó una solución inicial de cada extracto a 20 mg/mL, para la cual se usó dimetilsulfóxido (DMSO) como solvente.
Ensayo de actividad contra larvas de T. canis
La actividad antihelmíntica se determinó con la ayuda del procedimiento descrito por Márquez-Navarro A ycolaboradores 14 con algunas modificaciones. De manera abreviada, el ensayo se realizó en placas de 96 pozos de fondo plano. En cada pozo, se depositaron 25 larvas de T. canis que se incubaron con las soluciones problema, a concentraciones finales de 0,01; 0,05 y 0,1 mg/mL, en un volumen final de 200 µl/pozo. Se incluyeron controles de solvente y larvas sin tratar. El estado de las larvas se comprobó cada 24h bajo el microscopio invertido, hasta transcurrir 72 h. La actividad larvicida se midió en términos de movilidad relativa (MR), se utilizó el sistema de puntuación que desarrollaron Kiuchi y colaboradores,15como aparece en la tabla 2. Menor valor de MRindica una actividad nematicida superior. Se consideraron activos aquellos extractos que a una concentración de 0,1 mg/mL provocaron una movilidad relativa por debajo del 80% a las 72h.16Los ensayos se realizaron en triplicado y se confirmaron en tres experimentos independientes.
Ensayo de citotoxicidad
Células MRC-5 (fibroblastos humanos de pulmón)se incubaron en Medio Mínimo Esencial,que se suplementó con L-glutamina (20 mM), 16,5 mM de hidrógeno carbonato de sodio y suero fetal bovino al 5%, a 37 °C en atmósfera de CO2 al 5 %.17 Para el ensayo se depositaron 100 µl de la suspensión, que contenía15 000 células, en cada pozo de una placa de 96 pozos para cultivo. Luego de la formación dela monocapa, se retiró con cuidado el medio de cultivo y se añadieron los extractos diluidos en el medio de cultivo, en un rango desde 1,56 hasta 200 µg/mL. Los fibroblastos se mantuvieron durante 72 h, en atmósfera de CO2 al 5 %. Dimetil sulfóxido al 0,1 % y cultivos sin tratar se incluyeron como controles. La citotoxicidad se determinó mediante el ensayo con bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT, SIGMA, St. Louis, MO, EUA).18 De forma abreviada, luego del período de incubación, el medio se sustituyó por uno fresco al que se añadió MTT (0,5 mg/mL) y las placas se incubaron a 37 °C durante 4 h. Transcurrido ese periodo de tiempo el medio se extrajo y se adicionaron 100 µl de DMSO. La cantidad de formazan formada se detectómediante la determinación de la densidad óptica en un lector de ELISA (MRX Revelation, Dynex Technology) a 560 nm, se utilizó la lectura a 630 nm como referencia. Los ensayos se realizaron por triplicado y se confirmaron en dosexperimentos. Para finalizar se calculó el porcentaje deinhibición para determinar mediante interpolación lineal, la concentración citotóxica media (CC50).
RESULTADOS
]]> Una vez colectadas las plantas, se prepararon extractoshidroalcohólicos y se determinó el efecto de los mismos sobre el cultivo in vitro de larvas de T. canis. Los resultados de la actividad larvicida se muestran en la tabla 3. El valor del control se fijó a 100% y se correspondió con un máximo de movilidad. La MR en el control de solvente fue del 100 %, lo que indicó que el DMSO no interfiere con la determinación de la actividad larvicida. De los extractos ensayados, el extracto de Argemone mexicana y el extracto de C. papaya enriquecido en alcaloides resultaron activos contra las larvas de T. canis (MR a las 72h: 56,1±11,6 % y 67,1±0,99 %). El efecto larvicida comenzó a manifestarse desde las primeras 24h, incrementándose el valor de la MR con el tiempo deincubación. Los extractos de Aloe vera, Artemisia vulgaris, Centrosema virginianum y Chenopodium ambrosioides no mostraron actividad larvicida.Principios activos de medicamentos usados en el tratamiento de la toxocariasis,se ensayaron para comparar la actividad larvicida de los extractos. Albendazol, mebendazol y tiabendazol, resultaron activos contra el parásito, provocóvalores de MR similares entre ellos, pero no ocasionaronla mortalidad de todas las larvas, ni a la dosis mayor ensayada, transcurridas 72h.En este caso el efecto inhibitorio de la movilidad se comenzó a manifestar una vez transcurridas las 48 h.
A los extractos activos contra el parásito se les determinó la citotoxicidad sobre células MRC-5. No se encontró toxicidad para el extracto de C. papaya, enriquecido en alcaloides, ni para el extracto de A. mexicana, a la dosis mayor ensayada de 200g/mL.
DISCUSIÓN
La importancia de los productos naturales en la medicina moderna ha sido reconocida.19 Varios medicamentos se han originado de productos naturales, en especial antiparasitarios. Por ejemplo, dos de las principales drogas antimaláricas, la quinina y la artemisinina, se derivaron de plantas medicinales.20 Recién, se señaló la necesidad de encontrar nuevos antihelmínticos.21 Esto es válido de manera particularen el caso de la toxocariasis humana, pues los medicamentos recomendados, que pertenecen al grupo delos carbamatos benzimidazólicos, se caracterizan por poseer baja biodisponibilidad en los tejidos, debido a su baja solubilidad, lo que provoca un incremento en las dosis usadas y la prolongación del tratamiento.9 A pesar de esto, se han publicado pocos reportes acerca de la evaluación del efecto in vitro de productos sintéticos o naturales sobre las larvas de T. canis.
De las especies estudiadas, solamente C. papaya y A. mexicana resultaron activas contra el parásito. Según la búsqueda realizada en la literatura internacional es la primera vez que se evalúan contra el parásito. Sin embargo, de la primera especie se ha reportado que posee proteinasas de tipo cisteína con actividad nematicida. Por ejemplo, una dosis única de 450 mol de esas proteinasas proveenmayor eficacia contra la infección por Trichuris suis en cerdos, que una dosis oral de 400 mg de albendazol. Este hallazgo sugirió a los autores la posibilidad de obtener y validar una formulación oral para aplicación humana.22 Por otra parte, también se ha descrito actividad antiprotozoaria para extractos de esta planta, pero asociados a la presencia de alcaloides extraídos de las hojas. Una investigación, basada en informes etnobotánicos provenientes de Indonesia, señalaron a la carpaína como contribuyente a la alta actividad antiplasmodial in vitro, pero que no se mantuvo en el modelo murino in vivo.12 En la presente investigación se ensayó de manera especial unafracción enriquecida en alcaloides,entre los que se encontraba la carpaína, que se identificó mediante estudios de resonancia magnética nuclear.13
En cuanto a A. mexicana, el resultado sorprendió desde el punto de vista etnobotánico, al ser esta la única especie incluida en la investigación, para la cual no se había descrito el uso como antihelmíntica en Cuba. Al revisar la literatura internacional solo encontramosun reporte del estudio in vitrode algunas especies dela flora mexicana contra larvas de cuarto estadio de Haemonchus contortus, pero esta especie no se encontró entre las activas.23Un nuevo fitofármaco con propiedades antimaláricas derivado de la medicina tradicional denominado decocción de A. mexicana estaba en proceso de ser aprobado en Mali.24 Anterior a eso se había demostrado la actividadantimalárica in vitropara extractos preparados en solventes polares o acuosos preparados mediante decocción.25
Contrasta con nuestros resultados, el reporte de actividad toxocaricida de dos extractos de C. ambrosioidesque fueron preparados,usarondiclorometano y hexano. Este estudio fue desarrollado en Japón y los extractos resultaron efectivos in vitrocontra las larvas, aún a la concentración más baja ensayada de 0,01 mg/mL.26 La discrepanciapudiera deberse a la diferencia en los métodos de extracción, que pudiera redundar en diferenciasen la composición química de los extractos, tanto en cantidad, como en calidad de los metabolitos. Las propiedades antihelmínticas de C. ambrosioides se consideran históricamente debidas al monoterpeno ascaridol.27 Sin embargo más cercano a los díasMacDonald ycolaboradores verificaron que infusiones libres de ascaridol retenían las propiedades antinematódicas contra Caenorhabditis elegans.28 Lo que indica la presencia deotros metabolitos igual de importantes.
No se encontróinformes de actividad antihelmíntica para C. virginianum, A. vera, ni para A. vulgaris. Esta última,pertenece a la familia Asteraceae, que comprende especies con actividad toxocaricida.Por ejemplo, el extracto metanólico de Artemisia capillaris,a concentración de 0,1 mg/mL, redujo la movilidad de las larvas por debajo del 80 %, acompañado de baja toxicidad a células J774.1.29 Por otro lado, la administraciónoral del aceite de Artemisia absinthium a mascotas felinas, infectadasde manera natural por T. cati, produjo una reducción del número de huevos excretados/gramos de heces.30
]]> Aunque no existe consenso en la droga para el tratamiento de la toxocariasis humana, albendazol es el medicamentomás usado,3,4 seguido de tiabendazol y mebendazol. Sin embargo, como ha sido comprobado por varios autores, los dos primeros presentan una débil acción in vitro contra las larvas del parásito.14,16,26 Hecho que también fue corroborado en los experimentos. Similares resultados se obtuvieron para el mebendazol. Es de destacar que cuando estas drogas han sido ensayadas in vivo en modelos murinos de infección experimental, producen una marcada inhibición de la migración larvaria en los tejidos.31-33En el presente trabajo se identificaron dos especies de plantas medicinales cubanas como promisorias debido no solo al efecto contra las larvas in vitro, sino también a la ausencia de toxicidad sobre fibroblastos humanos. Son necesarios experimentos in vivo,enel modelo de infección experimental murino, como hospedero paraténico del parásito, para verificar el efecto sobre la carga larvaria en los tejidos. De confirmarse la actividad, el fraccionamiento guiado por bioensayos, permitirá aislar e identificar los metabolitos responsables.
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Recibido: 6 de enero de 2015.
Aprobado: 10 de junio de 2015.
Idalia Sariego Ramos . Instituto de Medicina Tropical “Pedro Kourí”. Autopista Novia del Mediodía Km 6 ½, Apartado Postal 601. La Lisa, La Habana, Cuba.
Correo electrónico:idalia@ipk.sld.cu
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