Estudio de inmunofenotipo por citometría de flujo para el diagnóstico de inmunodeficiencias primarias

Immunofenotype study by flow citometry for the diagnosis of primary immunodeficiencies

Consuelo Macías Abraham

Instituto de Hematología e Inmunología. La Habana, Cuba.

RESUMEN

Las inmunodeficiencias primarias (IDP) son un conjunto heterogéneo de enfermedades, en su mayoría de origen hereditario o congénito, cuyo diagnóstico requiere de la caracterización inmunológica de poblaciones y subpoblaciones celulares. Esta revisión, describe la metodología más actual a nivel internacional, basada en el proyecto denominado FITMaN (del inglés, Flow Immunophenotyping Technical Meeting at National Institute of Health ) para la caracterización celular que permite definir o avanzar en el diagnóstico correcto de estas entidades utilizando las bondades de la tecnología de la citometría de flujo. También, brinda nuevas opciones de investigación que permiten profundizar en el comportamiento del sistema inmunológico en estas enfermedades y su asociación con la expresión de marcadores moleculares y genéticos de interés.

Palabras clave: inmunodeficiencias primarias; citometría; inmunofenotipo.

ABSTRACT

Primary immunodeficiencies (PID) are a heterogenous group of diseases, mostly hereditary or congenital origin, which diagnosis requires the immunological characterization of cell populations and subpopulations. This review describes the international current methodology, based on the project called FITMAN (Flow Immunophenotyping Technical Meeting at National Institute of Health) for cell characterization that allows defines or forward to correct diagnosis of these entities using benefits of flow cytometry technology. Also, it provides new research options that allow deeper into the behavior of the immune system in these diseases and their association with the molecular expression and genetic markers of interest.

Keywords: primary immunodeficiencies; principio del formulario; cytometry; immunophenotype.

INTRODUCCIÓN

El estudio del fenotipo linfocitario incluye diferentes marcadores específicos de linaje en la superficie de la membrana celular, que se basa en el patrón de migración y diferenciación de cada subpoblación en el contexto del sistema inmune en el organismo. Por lo anterior, es de gran importancia conocer la cuantificación de poblaciones y subpoblaciones linfocitarias para orientar el estudio que permite profundizar en estas alteraciones y definir un diagnóstico en enfermedades que muestran un amplio polimorfismo clínico.

El protocolo FITMaN (del inglés, Flow ImmunophenotypingTechnical Meeting at National Institute of Health ) forma parte del Proyecto de Inmunología Humana, en inglés, Human Immunology Project Consortium (HIPC), que se realizó con el objetivo de una correcta caracterización del sistema inmune humano mediante el conjunto de 4 paneles de 8 colores por citometría de flujo para el inmunofenotipaje de células de sangre periférica ^7-11. Su estandarización se realizó para conseguir una metodología y configuración común para el procesamiento y análisis.

Para facilitar el diagnóstico, la Unión Internacional de Sociedades Immunológicas (IUIS) ha elaborado la siguiente clasificación de los diferentes grupos, en función de la afectación¹:

1. Immunodeficiencias combinadas

2. Síndromes de immunodeficiencias bien definidos

3. Deficiencias predominantes de anticuerpos

4. Enfermedades de desregulación inmunológica

5. Defectos congénitos del número y función de los fagocitos

]]> 6. Defectos de la immunidad innata

7. Desórdenes autoinflamatorios

8. Deficiencias del complemento

9. Adquiridas

Las IDP combinadas presentan anormalidades en la inmunidad mediada por células (linfocitos T), en la inmunidad mediada por anticuerpos (linfocitos B) y también en la inmunidad innata con ausencia o disminución de las células natural killer (NK), células dendríticas (DC) y monocitos. Es por ello que es necesario el estudio de estos tipos celulares para definir o avanzar en el diagnóstico correcto de estas entidades.

A continuación, se describen las características moleculares que definen fenotipos celulares y aportan datos de interés funcional que permiten profundizar en el comportamiento del sistema inmunológico en estas enfermedades y su asociación con la expresión de marcadores moleculares y genéticos de interés.

CÉLULAS T

Los linfocitos T se identifican mediante su separación de los linfocitos totales utilizando el marcador característico CD3. De estos se separan los linfocitos colaboradores (CD4+) de los citotóxicos (CD8+). A partir de cada uno de ellos, utilizando los marcadores CD45RA y el receptor de quimiocina tipo 7(CCR7) se distinguen los linfocitos naive o vírgenes (CCR7+CD45RA+), los linfocitos de memoria central (CCR7+CD45RA-), los linfocitos de memoria efectora (CCR7-CD45RA-)y los linfocitos efectores (CCR7-CD45RA+) ^7-10. (Fig. 1)

La separación de los linfocitos T CD4+ y CD8+ mediante CD45RA y CD45RO permite identificar las células T de memoria (CD45RA-/CD45RO+) y las células T vírgenes y efectoras (CD45RO-/CD45RA+). En cada grupo el marcador CCR7 permite diferenciar dentro de las células de memoria (CD45RA-), las de memoria central (CCR7+)y las de memoria efectora (CCR7-); y dentro de las células T que no son de memoria (CD45RO-/CD45RA+),las células vírgenes (CCR7+) y las células efectoras (CCR7-)^7-10.

Células T reguladoras : Los linfocitos T CD4+ se separan mediante marcadores característicos (CD3+CD4+). La estrategia de enfrentar CD25 vsCD127 permite identificar las células T reguladoras (CD25+CD127low). Concretamente, serán células T reguladoras aquellas que expresen el receptor de quimiocina tipo 4 y el CD45RO (CCR4+CD45RO+)(Fig. 2)¹⁶.

CÉLULAS B

Los linfocitos B se identifican mediante la caracterización (CD3-CD19+). La combinación de los marcadores IgD y CD27 permite la identificación de los linfocitos B vírgenes o naive (IgD+ CD27-), lascélulas de memoria previas al cambio de clase, en inglés,pre-switch memory(IgD+ CD27+),las de memoria con cambio de clase,en inglés switchmemory (IgD-CD27+) y las agotadas o exhausted B cells(IgD/CD27-) ¹⁷. (Fig. 3)

A partir de las células B vírgenes se distinguen lascélulas transicionales (CD38high CD24high), que están en un estado más inmaduro. A partir de las switch memory se pueden distinguir los plasmablastos (CD38+CD24-), que están en un estadio de maduración previo a las células plasmáticas; y utilizando los marcadores CD38 y CD20, una población que incluye plasmablastos y células plasmáticas (CD38+CD20+)¹⁷.

Entre los linfocitos B, a partir de su marcador de linaje CD19, se pueden identificar: linfocitos B vírgenes(CD21+CD27-) ,de memoria (CD21+CD27+), CD21low (CD21low CD27+) e inmaduros (CD21-CD27-) mediante la combinación de CD21 vs CD27. A partir de CD21low y con los marcadores CD21 vsCD38 se puede discernir entre los activados (CD21lowCD38-) y los transicionales inmaduros También se pueden diferenciar los linfocitos de memoria que han cambiado de clase y los que no, mediante la combinación de marcadores IgD e IgM, así como los que han pasado a plasmablastos (IgM-CD38+). Con los mismos marcadores, a partir de los linfocitos B vírgenes se identifican los linfocitos B transicionales y dentro de los linfocitos B,las células plasmáticas (CD38+CD138+)(Fig. 4) ¹⁷.

CÉLULAS DENDRÍTICAS/CÉLULAS NK/ MONOCITOS

Por exclusión de los linfocitos T y los linfocitos B, se hace una selección negativa de los CD3-CD19-CD20-; de esta, es que se seleccionan los monocitos y las células dendríticas y las células NK. Para diferenciar estos tipos celulares, en la misma ventana mediante la lectura de la combinación de marcaje con CD56 vs CD14 se distinguen los monocitos (CD56- CD14+) En los monocitos se puede distinguir entre los clásicos (CD14+CD16-) y los no clásicos(CD14+CD16+). (Fig. 5)

En las células NK(CD56+CD16+), mediante la combinación CD56 vs CD16 es posible distinguir entre los NKsbright y los NKsdim.

En la actualidad, Cuba cuenta con un Programa de Atención Integral al enfermo con IDP, el cual debe desarrollarse de manera más acelerada en el próximo quinquenio. La disponibilidad de tecnologías de avanzada, como son: la citometría de flujo, la hibridización "in situ" por fluorescencia (FISH) y la biología molecular, permitirá el diagnóstico más preciso de estas enfermedades lo que, asociado a la experiencia clínica, ubicará al Sistema Nacional de Salud en una posición favorable para la atención médica, con mejoras en el diagnóstico, la calidad de vida de los enfermos y la curación mediante el trasplante hematopoyético de las IDP.

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Recibido: agosto 08, 2016.
Aceptado: diciembre 27, 2016.