ARTÍCULO DE REVISIÓN
Mapeo Genético mediante desequilibrio de ligamiento por mezcla y su aplicación en enfermedades complejas
Genetic mapping by means of ligament unbalance by mix and its application in complex diseases
Candelaria Vergara; Beatriz Mercedes Martínez Alfaro ]]>
Laboratorio de Genética Molecular, Instituto de Investigaciones Inmunológicas, Universidad de Cartagena, Cartagena, Colombia.
La identificación de los genes implicados en enfermedades complejas es uno de los grandes desafíos en el campo de la genética humana. Dentro de las estrategias utilizadas para tal fin están los estudios de ligamiento en familias y los estudios de asociación poblacional usando casos y controles. Sin embargo, una alternativa propuesta en los últimos años es el método de mapeo genético por desequilibrio de ligamiento por mezcla, también denominado "Admixture Mapping" (AM). Es una estrategia que metodológicamente se ubica entre los estudios de ligamiento en familias y los rastreos genómicos para asociación y que es aplicable a poblaciones genéticamente mezcladas.
Palabras clave: AMs, marcador de ancestría, enfermedades complejas, poblaciones mezcladas, Mapeo genómico
Characterization of gens involved in complex diseases is one of greatest challenges in field of human genetics. Included in the more used strategies to this objective are studies of ligament in families, and studies of population association, using cases and controls. However, in pas years an alternative proposal is the genetic mapping method by unbalance of ligament by mix, also called "Admixture Mapping" (AM). It is an strategy that methodologically is placed among ligament studies in families and the genomic searching for association, and it is applicable in populations presenting with genetic mixture.
Key words: AMs, ancestral marker, complex diseases, mixed populations, genomic mapping
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MEZCLA POBLACIONAL Y MAPEO GENÉTICO POR DESEQUILIBRIO DE LIGAMIENTO POR MEZCLA
La mezcla poblacional es la formación de una población nueva mediante el entrecruzamiento de dos poblaciones genéticamente divergentes (parentales) seguida por el apareamiento de sus descendientes 1 cuyos genomas están compuestos de fragmentos cromosómicos originados en las distintas poblaciones parentales. Durante la mezcla se genera en forma transitoria el denominado "desequilibrio de ligamiento por mezcla" (ALD, por sus cifras en inglés: Admixture Linkage Disequilibrium) en los individuos de la población híbrida, consistente en grandes bloques de haplotipos y asociaciones no aleatorias entre polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs por su nombre en inglés Single Nucleotide Polymorphism) a lo largo de distancias de cientos de centimorgans (cM). La longitud de los bloques depende en gran medida de las proporciones en la contribución de las poblaciones parentales y el grado de mezcla contínua y reciente entre la población nueva y cualquiera de las parentales. 2 El ALD, el cual surge principalmente entre los loci que tienen distintas frecuencias alélicas entre las poblaciones parentales, disminuye en función de la tasa de recombinación entre los loci y el tiempo representado por el número de generaciones después del evento de mezcla. 3 La disolución del ALD es rápida entre aquellos loci separados por distancias mayores de 30 cM o entre loci ubicados en diferentes cromosomas pero persiste por más tiempo y es más difícil de disolver entre los loci separados por distancias menores a 10cM.
El ALD es la base genética del AM; este consiste teóricamente en hacer un rastreo genómico, ya sea en casos y controles o en casos solamente, pertenecientes a una población mezclada en la que una de las poblaciones parentales tiene una mayor incidencia de la enfermedad identificando inicialmente los segmentos genómicos provenientes de cada población parental mediante el uso de marcadores informativos de ancestría (AIMs, por Ancestry Informative Markers). De manera que si un segmento específico que proviene de la población parental con mayor incidencia de la enfermedad se encuentra en una frecuencia significativamente mayor en casos que en controles, es sugestivo de que en él se localiza el gen o alelo asociado con la enfermedad. 1 A este análisis inicial le sigue el mapeo más denso de la región o regiones identificadas y la caracterización de los genes
candidatos contenidos en esa región. Este método tiene el mismo poder que los rastreos genómicos para asociación en poblaciones homogéneas y tiene las ventajas de que no es influenciado por la heterogeneidad alélica y que además puede realizarse a un menor costo debido a que se usan entre 1,200 y 3,000 marcadores, es decir, unas 200 a 500 veces menos que los rastreos genómicos.
Diseño de mapeos genéticos mediante desequilibrio de ligamiento por mezcla
Aunque las bases teóricas del AM fueron descritas originalmente hace más de una década, 3 sólo hasta ahora ha sido factible su realización gracias al desarrollo de páneles de AIMS cada vez más específicos para cada población y la disponibilidad de genotipificación a gran escala. A pesar de que la información sobre SNPs y haplotipos derivada de los proyectos Genoma Humano y HapMap es muy útil en el desarrollo de paneles de AIMs que diferencian ancestría Africana y Europea, estos proyectos no incluyen individuos de poblaciones Amerindias, lo que limita así el diseño de mapas de marcadores para las poblaciones Latinas. Sin embargo, en un esfuerzo colectivo, un grupo de investigadores analizaron varias bases de datos personales y públicas y seleccionaron 1.646 marcadores distribuidos a lo largo del genoma para conformar un panel discriminativo de las poblaciones Europea, Amerindia y Africana, las tres principales poblaciones fundadoras de las poblaciones Latinas actuales; de manera que en la actualidad ya es posible aplicar este método a poblaciones como la Colombiana. De hecho, la efectividad de este grupo de marcadores fue validada experimentalmente, con excelentes resultados, en 232 muestras provenientes de una población latina habitante en Norteamérica, mejicanos, brasileros y colombianos. 4 Por su parte, en otro estudio publicado simultáneamente, se describió otro grupo de 2.120 AIMS que diferencia específicamente ancestría Europea/Africana de la Amerindia (discriminando para Meso América y Suramérica) con una distancia genética y física promedio entre marcadores de 1.74 cM y 1.22 Mb (SD+/-832kb), respectivamente. Según los autores, el diseño de este panel, en el que se excluyeron AIMs con frecuencias alélicas significativamente diferentes entre poblaciones Amerindias de Norte y Suramérica, permite usarlo para hacer AM en muchas poblaciones mezcladas a lo largo del continente Americano. 5
En términos prácticos, el AM es un proceso que consta de varios pasos: el primero es seleccionar la población mezclada y estimar el tamaño muestral de la población a utilizar en el AM que tenga un poder aceptable (> 0.8). El tamaño muestral depende de varios factores como las proporciones de ancestría en la población mezclada, los cuales se pueden determinar analizando inicialmente varias docenas de AIMs. Las proporciones a su vez dependen de las contribuciones de las poblaciones parentales y de la dinámica de la mezcla, es decir si hubo un único evento de mezcla inicial entre las poblaciones parentales o en forma alternativa, si además del evento inicial, las poblaciones parentales siguieron mezclándose con la nueva población híbrida en forma contínua a través del tiempo (flujo genético contínuo). Otro factor determinante en el tamaño muestral es el riesgo relativo atribuible a la etnicidad, definido por algunos autores como la relación entre el riesgo de una ancestría sobre la otra (s) 6 y que es igual a la relación de riesgos genotípicos (GRR por Genotypic Risk Ratio) en el caso de que la variante causante tenga frecuencias extremas en las poblaciones fundadoras (0 y 100%). El mínimo GRR detectable en un AM es 1.5 en estudios que analizan varios miles de individuos afectados. 6-8 ]]>
El segundo paso es establecer el número, densidad y tipo de marcadores a utilizar. El número y la densidad están relacionadas con el número de generaciones desde el evento de mezcla dado que de esto depende el tamaño y distribución del ALD; a mayor número de generaciones, menor es el tamaño de los bloques de ALD y mayor el número de marcadores a utilizar, asumiendo sólo un evento de mezcla inicial sin contribución posterior de las poblaciones parentales. Los marcadores a utilizar, ya sean microsatélites (STRs, por sus siglas en inglés Short Tamden Repeats) o SNPs se escogen dependiendo de la informatividad de los mismos; aunque los STRs son más informativos, la tendencia es a usar "mapas" de SNPs dada la mayor facilidad para tipificarlos a gran escala. Existen varias medidas de informatividad, la más sencilla desde el punto de vista estadístico es r, que es la diferencia absoluta en las frecuencias alélicas de cada AIM entre las poblaciones parentales; se considera que un buen "mapa" esta compuesto de marcadores con SNPS cuyos rs sean >0.6 entre las poblaciones parentales. 1 La informatividad individual de los marcadores es indicativa de la habilidad del "mapa" para extraer la información de ancestría en la población mezclada, es decir, para asignar la ancestría de los distintos segmentos cromosómicos. Por ejemplo un "mapa" de 4.222 AIMs diseñado para Afro americanos fue capaz de extraer más del 70% de información de ancestría para el 90% del genoma asumiendo un modelo con 6 generaciones después del evento de mezcla, flujo genético continuo y una relación de ancestría Africana: Europea de 80:20. 9 En el caso de las poblaciones mejicanas que viven en Norteamérica, las cuales tuvieron una mezcla más antigua (15 generaciones) y proporciones de ancestría europea: amerindia de 50:50, se necesitaría un "mapa" con 5000 AIMs para tener un poder aceptable. Uno de los "mapas" mencionados antes para poblaciones latinas tienen un 50% de informatividad para AM en estas poblaciones, 4 un porcentaje muy similar al primer "mapa" descrito para Afroamericanos. 10Toda la información obtenida de los AIMs debe ser analizada en conjunto para obtener las proporciones de ancestria a lo largo del genoma y hacer las comparaciones ya sea entre casos y controles o entre los distintos segmentos del genoma en casos. Los programas de computador disponibles para el público actualmente son ANCESTRYMAP, 8 ADMIXMAP 7 y STRUCTURE/MALD; 11 además de un nuevo algoritmo descrito por Tang y colaboradores el cual tiene en cuenta el desequilibrio de ligamiento en las poblaciones parentales. 12 ANCESTRYMAP utiliza la prueba Bayesiana de razón de probabilidades para calcular la ancestría genómica individual y obtiene el promedio de toda la población analizada; con ese valor como base, identifica las regiones genómicas con la mayor ancestría de la población parental con mayor incidencia de la enfermedad en las cuales puede estar el gen asociado. Aunque no necesita de controles para hacer las asociaciones entre ancestría y la enfermedad, es recomendado incluirlos para estimar en forma robusta las frecuencias alélicas de las poblaciones ancestrales y así incrementar el poder del análisis. ADMIXMAP utiliza fundamentos estadísticos tanto Bayesianos como clásicos; permite inferir un modelo de historia de la mezcla dado que estima la distribución de la ancestría individual y la variación estocástica de la ancestría de los cromosomas híbridos mediante el método de simulación de cadenas de Markov vía Monte Carlo. Este método puede analizar poblaciones mezcladas con más de dos poblaciones ancestrales y es capaz de manejar marcadores bialélicos y multialélicos para hacer análisis de asociación de la ancestría tanto con rasgos dicótomos (enfermedad si/no) como con rasgos cuantitativos (Niveles séricos de IgE total). 13 ADMIXMAP tiene la ventaja de que reconstruye la estructura genética de poblaciones ancestrales aunque no haya disponibilidad de muestras de esos individuos a diferencia del ANCESTRYMAP en el que el usuario debe aportar la información de las poblaciones parentales para hacer el análisis. Los programas STRUCTURE y MALD, por su parte, son programas complementarios que usan la información de los genotipos de AIMs en casos y controles provenientes de la población mezclada y de individuos representativos de las parentales; no asumen un modelo particular de la enfermedad y analizan qué tanto la ancestría de un locus se desvía del promedio genómico. De acuerdo con los autores, estos dos programas tienen la ventaja de que no se requiere que los marcadores sean necesariamente informativos de ancestría sino que se puede hacer el cálculo con SNP distribuidos al azar en el genoma. 11
En el caso de que se quiera diseñar un estudio de AM en la población Colombiana, es necesario tener en cuenta que los estimados de ancestría poblacional varían de una región a otra, dependiendo de la historia demográfica de cada población. Por ejemplo, para el departamento de Antioquia, la ancestría es 79% europea, 15% amerindia y 6% africana. 14 En esta población considerada como aislada, la dinámica de mezcla se describió como una inmigración inicial antes del siglo XVIII y una subsiguiente expansión de la población por crecimiento interno de la misma con bloques de LD más largos que otras poblaciones no aisladas 15 por lo que teóricamente requeriría un gran número de marcadores para hacer AM. Para otras poblaciones colombianas, es necesario hacer un estudio inicial que analice las características étnicas y genéticas y de esa manera establecer las bases metodológicas para el AM.
Mapeos de desequilibrio de ligamiento por mezcla y enfermedades complejas
EL AM ha sido utilizado con éxito para la búsqueda de genes de susceptibilidad para rasgos y enfermedades complejos. Zhu y colaboradores llevaron a cabo un AM para hipertensión arterial, la cual tiene una mayor prevalencia y severidad en poblaciones de origen africano. Estos investigadores tipificaron 269 STRs distribuidos en el genoma en 737 casos y 573 controles Afro americanos tomando como poblaciones parentales 236 individuos de Nigeria y 293 Euro americanos. 16 Utilizando STRUCTURE, los autores encontraron una mayor ancestría africana en los casos y una asociación entre la enfermedad y marcadores ubicados en 6q24 y 21q21. En esta población también se hizo un AM para cáncer de próstata, el cual tiene una mayor incidencia en poblaciones de ascendencia africana. Se incluyeron 1597 individuos no relacionados y se encontró asociación con un segmento de 3.2 Mb en el cromosoma 8p24. 17 Por su parte, en la esclerosis múltiple se ha determinado que existe un mayor riesgo para poblaciones de origen Caucásico en comparación con las africanas, lo que la convierte en otro candidato para analizar mediante AM en poblaciones mezcladas. En un estudio con un alto poder estadístico realizado en Afroamericanos, se tipificaron 1558 SNPs en 605 casos y 1043 controles, encontrándose una asociación de la enfermedad con un locus ubicado en el cromosoma 1. 18 La mayoría de las asociaciones encontradas en estos estudios están en concordancia con resultados anteriores obtenidos en estudios de ligamiento lo que aporta confiabilidad a los resultados.
El AM es aplicable a la poblaciones mezcladas para identificar los factores genéticos de susceptibilidad para las enfermedades previamente anotadas arriba y también para asma, una enfermedad compleja y multifactorial que tiene una mayor prevalencia y severidad, cursa con niveles más altos IgE total y con una mayor dependencia de esteroides en poblaciones africanas en comparación con poblaciones blancas 19y amerindias, aún después de descartar las variables socioeconómicos como causales, lo que indica que los factores genéticos podrían ser los responsables de estas diferencias entre los grupos étnicos.
CONCLUSIÓN
El mapeo por desequilibrio de ligamiento por mezcla es una estrategia novedosa de epidemiología genética susceptible de realizar en poblaciones con una mezcla reciente como la colombiana y las del Continente Americano en general, que ha demostrado ser útil en la investigación de genes de susceptibilidad asociados con rasgos y enfermedades complejas con prevalencias variables de acuerdo a la etnicidad. Su implementación se ve facilitada cada día más debido a la mayor disponibilidad de bases de datos sobre la variantes genéticas en los distintos grupos étnicos, el desarrollo de mejores y más eficaces métodos de genotipificación a gran escala y el diseño de algoritmos bioestadisticos y robustos programas de computación para el manejo de grandes bases de datos. Esta estrategia puede ser de mucha utilidad para la identificación de factores de riesgo genético para varias enfermedades complejas como el asma.
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Recibido: Abril 2008
Aprobado: Mayo 2008
Candelaria Vergara, MSc, Profesor Auxiliar, Actualmente Estudiante de doctorado en Genética de Poblaciones, Pie de la Popa, Edificio Parque Real apto 2ª3, Cartagena, Bolívar
Beatriz Mercedes Martínez Alfaro, MSc, Profesor Asociado, Jefe del Laboratorio de genética Molecular del Instituto de Investigaciones inmunológicas, San diego Calle de la Tablada 7-57, Cartagena, Bolívar Colombia ]]>