Palabras clave: INSULINA; CRISTALIZACION.
Para garantizar dicha acción prolongada en los pacientes, los cristales de insulina en el componente cristalino del producto final deben alcanzar un tamaño final entre 10 y 40 m según prescribe la Farmacopea.1
En el presente trabajo se analiza la influencia de factores de especial interés, tales como el contenido de iones Zn2+, el pH, el tamaño de semilla inoculada y la adición de un surfactante en el medio de cristalización sobre el proceso de crecimiento de los cristales.
Dicho medio de cristalización se prepara con un contenido de insulina porcina altamente purificada de alrededor de 1 % p/v, 7 % p/v de NaCl, una proporción entre 8 y 9 mg de iones Zn2+ por cada gramo de insulina para garantizar una relación de 4 átomos de Zn2+ por cada hexámero, así como un contenido equivalente a 0,1 M de acetato de sodio trihidratado y suficiente NaOH 2N para alcanzar un pH correspondiente al punto isoeléctrico de la insulina (entre 5,45 y 5,55). La composición química del medio en cuanto a concentración de Zn2+ fue verificada mediante técnicas de espectrometría de absorción atómica y espectrofotometría UV;1,6 en cuanto al contenido de Cl-, mediante el método establecido con nitrato de plata. Asimismo, se estudió la adición de polisorbato 80 como agente tensoactivo al medio de cristalización en determinados ensayos. El desarrollo de los cristales se observó mediante muestreos cada 1 h a través de un microscopio óptico OLYMPUS BH-2 y con el empleo de las técnicas de distribución de tamaño de partículas. De igual forma, se analizó el producto final obtenido a partir de su componente cristalino correspondiente.
En estas condiciones se plantea, como unidad mínima, la formación de complejos cristalinos de 2 átomos de Zn2+ por cada hexámero de insulina. No obstante, se ha demostrado que, la presencia de iones haluro como el Cl-, de ser éste adicionado al medio cristalino, promueve la formación de complejos cristalinos mejor estructurados de 4 átomos de Zn2+ por cada hexámero de insulina.3,9 La estructura de estos cuerpos cristalinos tiende fundamentalmente a la de formas rombohédricas que ya han sido estudiadas por diferentes investigadores (Schlichtkrull J. Insulin Crystals: Chemical and Biological Studies on Insulin Crystals and Biological Studies on Insulin Crystals and Insulin Zinc Suspensions, Thesis).
Asimismo, el pH no sólo asegura las necesarias condiciones de sobresaturación (mínima solubilidad de la insulina) en el medio de cristalización, sino que también interactúa con las demás variables, específicamente aquéllas relacionadas con la composición química del medio.10
En aquellos ensayos donde se comprobó que la composición química del medio era la adecuada, predominó la existencia de cristales rombohédricos, y se observó su presencia en las muestras analizadas a través del microscopio en una proporción entre 90 y 95 % del total de cuerpos cristalinos observados.
En los demás casos, donde aparece mayor cantidad de cristales rotos en una proporción entre 15 y 20 % del total de cuerpos cristalinos observados, se pudo comprobar la existencia de un déficit en el contenido de iones Cl-, lo cual produce un desplazamiento del estado de equilibrio hacia la formación de la estructura 2 Zn2+ por cada hexámero de insulina.
Esto unido a los resultados negativos obtenidos en cuanto al poco desarrollo del tamaño de los cristales en aquellos ensayos donde existía un déficit del contenido de iones Zn2+ en el medio de cristalización, llevó a corroborar la importancia de mantener un adecuado balance en el medio en lo que a composición química y pH se refiere para obtener, al final del proceso de cristalización, los resultados esperados. ]]>
En cuanto al tamaño de semilla, el área superficial específica (ASE), relacionada directamente con el tamaño y la geometría de los cristales, influye decisivamente en su velocidad de crecimiento, así como en su distribución de tamaño.En la figura se observa que, a medida que el tamaño de la semilla es menor, y por ende mucho mayor el ASE, la cinética de crecimiento se incrementa de tal forma que, para cristales de partida de alrededor de 2 m al cabo de las 10 h se ha alcanzado prácticamente el máximo tamaño posible de cristales. Por otra parte, mediante la inoculación de semilla de mayor tamaño, como los casos de 6,8 y 10 m donde el ASE es menor, el desarrollo de los cristales se verifica de forma más lenta.
Teniendo en cuenta la posibilidad de incrementar la cinética de crecimiento de los cristales reduciendo la actividad superficial de la solución y su viscosidad, se decidió la realización de 2 ensayos adicionales en los que se mantuvieron las mismas condiciones en el medio de cristalización en cuanto a composición química, pH, etcétera, y se adicionó en uno de ellos, un surfactante (polisorbato 80) en suficiente proporción al medio.11
Como resultado de esta prueba se obtuvo, al final de ambos ensayos, un componente cristalino con una distribución de tamaños relativamente estrecha (entre 10 y 30 m, sólo que en el caso del ensayo con surfactante se obtuvo un tamaño medio de 23,1 ±0,3 m), mientras en el otro ensayo, se obtuvo un resultado de 23,0 ± 0,4 m (para un intervalo de confianza del 95 %).
Ante la posible duda de que la adición de surfactante hubiera influido positivamente en el tamaño final de los cristales, se llevó a cabo una prueba de hipótesis por diferencia donde se planteó, como hipótesis nula, la no existencia de diferencia significativa entre ambos tamaños de cristales alcanzados.12
Para un nivel de significación establecido del 95 %, se corroboró por vía estadística (pruebas F de Fisher y t de Student, ver tablas 1 y 2) la aceptación de la hipótesis nula, luego no existe diferencia significativa entre ambos ensayos desde el punto de vista del tamaño medio de los cristales, y por lo tanto, la adición de surfactante al medio de cristalización no contribuye decisivamente a la obtención de cristales de mayor tamaño al final del proceso de cristalización. Evidentemente, esta condición depende de la cantidad de insulina a cristalizar presente en el medio al inicio, la cual se mantuvo invariable entre un ensayo y otro.
No obstante, se detectó un relativo aumento en cuanto a la rapidez con que se llevó a cabo el proceso de cristalización. Baste decir que, sin la adición del surfactante en el medio de cristalización, se alcanzó un tamaño medio de 22 m en la primera hora, mientras que con la adición de surfactante se alcanzó en el mismo intervalo de tiempo, un tamaño medio de 23,4 m, lo cual significa un incremento de la velocidad de cristalización en los primeros instantes de tiempo de alrededor de 6,6 %. Dicho incremento puede ser no significativo a escala de laboratorio, pero sí puede adquirir relativa importancia en preparaciones de mayor volumen.
<3>Licenciada en Ciencias Farmacéuticas.
<4>Licenciado en Química.
<5>Licenciada en Ciencias Farmacéuticas.
<6>Doctor en Ciencias Farmacéuticas.
<7>Ingeniero Químico.
<8>Licenciado en Química.