Selección de rizobios adaptados a ecosistemas ganaderos de Sancti Spíritus, Cuba, inoculados en maíz (Zea mays, L.). Fase I: Invernadero

C.J. Bécquer¹, Beatriz Salas¹, *D. Archambault², J. Slaski² y A. Anyia²

¹ Estación Experimental de Pastos y Forrajes Sancti Spíritus, Cuba

E-mail: becquer@pastos.yayabo.inf.cu

² Department Environmental Technologies, Alberta Research Council, Vegreville, AB, Canada

E-mail: slaski@arc.ab.ca ]]> * Dirección actual: Laurentian University, 935 Ramsey Lake Road, Sudbury, ON

E-mail:DArchambault@laurentian.ca

Se efectuó un ensayo en invernadero con el objetivo de seleccionar cepas de rizobio inoculadas en maíz (Zea mays, L.). Para ello se utilizaron 30 cepas nativas cubanas pertenecientes a Bradyrhizobium sp., así como 12 cepas comerciales, pertenecientes a diferentes géneros y especies de rizobio. Los inóculos se confeccionaron en medio CLM y fueron agitados hasta alcanzar un título de 10⁶-10⁸ cél./mL. Se utilizaron los métodos estándar para la inoculación de cereales. Se evaluaron las variables: peso seco aéreo (PSA), peso seco raíz (PSR), longitud del tallo (LT), diámetro del tallo (DT) y presencia de mazorcas (PM). En las variables PSA, LT y DT se hallaron tratamientos superiores al control absoluto, y en el caso de la LT, dos tratamientos presentaron valores sin diferencias significativas a los del control fertilizado. No se detectaron diferencias estadísticas entre tratamientos en la PM. En el PSR los tratamientos inoculados fueron inferiores al control fertilizado, excepto JI2, TD1, SP7 y SP12. Se obtuvo una agrupación en conglomerados, mediante la cual se seleccionaron las cepas TD, JK, SP, SP, TE, JK, SP, USDA 110, JI, JJ, USDA 76, SP, 25B6, SP, NITRAGIN, ATCC 10317, que se destacaron para su posterior evaluación en condiciones de campo. Los tratamientos seleccionados en el dendrograma constituyeron el 69% para las cepas nativas y el 31% para las comerciales. Al evaluar los tratamientos inoculados en cuanto al grado de dependencia de las diferentes variables con respecto al PSR, se determinó que el índice de regresión fue débil, pero al analizarlos por separado, se observó una regresión fuerte en las variables DT (cepas nativas) y PSA (cepas comerciales). Se recomienda la continuación de estas investigaciones en condiciones de campo.

Palabras clave: Bradyrhizobium, inoculación, Zea mays

Key words: Bradyrhizobium, inoculation, Zea mays

MATERIALES Y MÉTODOS

Identificación de las cepas de rizobio. Se utilizaron 30 cepas procedentes de leguminosas naturalizadas de Sancti Spíritus, Cuba (Centrosema, Neonotonia y Stylosanthes). Estas cepas fueron confirmadas en trabajos anteriores como rizobios y ubicadas taxonómicamente en el género Bradyrhizobium sp. (Bécquer, 2003). Se utilizaron también 12 cepas comerciales pertenecientes a diferentes géneros y especies de rizobio (tabla 1).

Preparación de los inóculos. Los inóculos se confeccionaron en medio CLM (caldo-levadura-manitol) (Somasegaran y Hoben, 1994), a partir de una asada de cultivos frescos en medio agarizado. Se colocaron en agitación (120 rpm) durante siete días (para las especies de lento crecimiento) o de tres a cuatro días (especies de rápido crecimiento), en una zaranda orbital a 30^oC, hasta alcanzar un título UFC (unidad formadora de colonias) de 10⁶-10⁸ cél./mL Ensayos de invernadero. Se escogió la variedad de maíz 2338 F15, donada por el Alberta Research Council, Canadá. Las semillas fueron pregerminadas previamente a su siembra en macetas. Cada maceta contenía 1,0 kg de suelo estándar mezclado con bajo nivel de N: 30 ppm (mg/kg). Se ralearon las macetas a los cuatro días de la siembra hasta dejar dos plantas por maceta. Se utilizaron los métodos estándar para la inoculación de los cereales (Sabry, Saleh, Batchelor, Jones, Jotham, Webster, Kothari, Davey y Cocking, 1997; Biswas, Ladha y Dazzo, 2000), con cambios en la frecuencia y la cantidad de inóculo. El inóculo bacteriano en cantidad de 3 mL/planta, que contenía 10⁶-10⁸ cél./mL, se aplicó a los cinco días de la siembra y, consecutivamente, se realizaron otras tres inoculaciones con el mismo título (6 mL/planta, 12 mL/planta, y 12 mL/planta, respectivamente), a los 20, 30 y 40 días de la siembra, con un total de cuatro inoculaciones por maceta. Se evaluaron las plantas a los 90 días de la siembra, excepto la presencia de mazorcas (PM), a los 60 días de la siembra. El resto de las variables medidas fueron: peso seco aéreo (PSA), peso seco raíz (PSR), longitud del tallo (LT) y diámetro del tallo (DT) datos correspondientes a PM fueron transformados por el coeficiente de Barlett, según Lerch (1976).

Diseño experimental y análisis estadístico. Se empleó un diseño en bloques al azar con 44 tratamientos y cuatro réplicas. Se incluyó un control absoluto y uno con un portador nitrogenado (NH₄NO₃, 150 kg N/ha). Se realizó un ANOVA mediante el paquete estadístico StatGraphics Plus, versión 2.0, 1994-1996, Statistical Graphics Corporation. Las diferencias entre medias se hallaron mediante la prueba de LSD de Fisher y se tomó en consideración la desviación estándar (DE). Se construyó un dendrograma mediante el método de Ward (distancia euclidiana).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

En el peso seco aéreo se constataron cuatro tratamientos inoculados con cepas nativas: JI₂ (12,75 g/maceta), JK₁ (12,44 g/maceta), SP₇ (12,69 g/maceta) y SP₂₁ (13,43 g/maceta) que fueron estadísticamente superiores (P<0,05) al control absoluto (tabla 2), lo cual representó un incremento del 25,5% (JI₂), 22,4% (JK₁), 27,0% (SP₇) y 32,2% (SP₂₁). Estos valores fueron superiores a los encontrados por Prévost, Saddiki y Antoun (2000) en un experimento donde se inoculó maíz con cepas comerciales de Bradyrhizobium japonicum, en el cual se obtuvieron incrementos en el PSA de la planta desde un 6,7% hasta 8,7% en comparación con el control absoluto. También fueron superiores a los datos obtenidos por Antoun y Prévost (2000), con la cepa P31 de Rhizobium leguminosarum, al ser inoculada en maíz. Por otra parte, en este experimento los tratamientos inoculados con cepas comerciales presentaron superíndices comunes con respecto al control absoluto, en cuanto a PSA, PSR y NM. Estos resultados pudieran deberse a una mayor secreción total de sustancias promotoras del crecimiento vegetal por las cepas nativas; o a la secreción por éstas de determinadas fitohormonas mayormente dirigidas al desarrollo de partes aéreas de la planta, con un efecto superior en comparación al de las cepas comerciales. Según Biswas et al. (2000) los microorganismos diazotrofos pueden promover el crecimiento vegetal mediante la transferencia del N₂ fijado, o mediante el mejoramiento de la absorción de nutrientes a través de la modulación de actividades hormonales en las plantas inoculadas. Otra posibilidad es en cuanto al mecanismo de entrada de los rizobios en las raíces de los cereales, ya que se conoce que dicho mecanismo es diferente al realizado en la simbiosis leguminosa rizobio (Reddy, Ladha, So,Hernández, Ramos, Ángeles, Dazzo y de Bruijn, 1997), el cual depende principalmente de la capacidad de la bacteria (cepas) para romper las paredes de la célula vegetal, y no de reacciones bioquímicas basadas en dependencias genéticas específicas.

Aunque Lupwayi y Clayton (2004) plantearon que los rizobios pueden actuar como promotores del crecimiento vegetal y cambian la fisiología y morfología de las raíces inoculadas, en este experimento en la variable peso seco raíz ningún tratamiento presentó diferencias significativas con el control absoluto y todos fueron estadísticamente inferiores al control fertilizado (3,80 g/maceta). Algunos tratamientos, como los inoculados con JI₂ (3,15 g/maceta), TD₁ (3,04 g/ maceta), SP₇ (3,11 g/maceta) y SP₁₂ (3,00 g/maceta), mostraron una tendencia estadística al incremento de sus valores, por presentar superíndices superiores con respecto al control absoluto. También Bécquer et al. (2006), al inocular trigo en condiciones de invernadero, hallaron 27 tratamientos, inoculados indistintamente con cepas nativas y comerciales, cuyos valores fueron estadísticamente iguales a los del control absoluto en el peso de la raíz. Estos resultados apuntan necesariamente a una escasa secreción, por parte de las cepas, de fitohormonas específicas al desarrollo radicular, aunque no se descartan otras variantes. En la longitud del tallo, excepto los tratamientos inoculados con TE₁ (53,93 cm), TE₄ (55,63 cm), HA₃ (61,63 cm), HG₂ (61,88 cm), JH₁ (61,88 cm), JJ₄ (60,13 cm), JK₃ (61,50 cm), SP₁ (60,88 cm), SP₈ (60,88 cm), SP₁₆ (61,13 cm), SP₁₈ (61,00 cm), SP₂₃ (60,25 cm) y ATCC9930 (61,50 cm), los demás resultaron estadísticamente superiores (P<0,05) al control absoluto y dos de éstos, sin diferencias significativas con el control fertilizado (TD₁: 74,68 cm y JK₁: 73,38 cm).

Esto indica una fuerte dependencia del crecimiento de la planta con relación al desarrollo radicular, quizás basada en el mecanismo de emisión de fitohormonas específicas por parte de estas cepas. Sin embargo, al inocular trigo con cepas cubanas, Bécquer et al. (2006) encontraron que los tratamientos inoculados con las cepas mencionadas anteriormente (excepto HG₂, JJ₄ y JK₃) presentaron superíndices comunes con el control absoluto. Resultados similares se encontraron en maíz, al ser inoculado con cepas canadienses (Bécquer, Salas, Archambault, Slaski y Anyia, 2008) en condiciones de invernadero.

Al parecer, estos mecanismos pudieran variar de acuerdo con el tipo de cultivo que se inocula, aunque deben efectuarse otras evaluaciones para determinar las verdaderas causas. En la variable diámetro del tallo sólo cinco tratamientos inoculados con cepas nativas fueron estadísticamente superiores (P<0,05) al control absoluto (TD₁: 10,60 cm, TD₄: 10,70 cm, JI₂: 11,05 cm, SP₇: 10,55 cm y SP18: 10,45 cm) y ninguno superior al control fertilizado. Según Yanni (2001), los beneficios de la asociación rizobio cereal conllevan una mayor producción de la biomasa vegetativa y reproductiva, y están mayormente relacionados con la modulación de la arquitectura radicular de la planta, provocada por el rizobio para una mejor adquisición de algunos nutrientes del suelo, más que por la fijación biológica del dinitrógeno. En cuanto a la presencia de mazorcas a los 60 días de la siembra, todos los tratamientos presentaron letras comunes con el control fertilizado y el control absoluto, por lo que esta variable no fue lo suficientemente discriminante como para seleccionar las cepas por su efecto fisiológico en la planta. ]]> En el dendrograma (fig. 1) se muestran dos grandes conglomerados: el 1, compuesto por el control fertilizado y 16 tratamientos, que constituyen aquellas cepas que mostraron valores estadísticos superiores en una o más variables (TD₁, JK₆, SP₁₂, SP₇, TE₄, JK₁, SP₂₁, USDA 110, JI₂, JJ₆, USDA 76, SP₂₀, 25B6, SP₁₅, NITRAGIN, ATCC 10317) (tabla 2). Por otra parte, el con glomerado 2 incluyó un total de 26 tratamientos y el control absoluto, agrupados de forma independiente, donde el 2.1.1 lo integraron el control absoluto y el tratamiento TE.

Este tratamiento presentó los valores estadísticamente inferiores con respecto al control fertilizado en las distintas variables, excepto en la presencia de mazorcas, y no difirió del control absoluto en todas las variables (tabla 2). Los tratamientos seleccionados positivamente en el dendrograma constituyeron el 69% para las cepas nativas y el 31% para las comerciales.

Al evaluar todos los tratamientos inoculados con cepas nativas o comerciales, indistintamente, en cuanto al grado de dependencia entre variables, se determinó que el índice de regresión fue relativamente débil en todos los casos analizados: r² = 21,7% para la variable dependiente PSA y la independiente PSR (fig. 2), así como r²= 9,6% para LT y PSR (fig. 3), r² = 21,3% para DT y PSR (fig. 4) y r² = 4,3% para PM y PSR (fig. 5).

Sin embargo, al separar los análisis por el origen de las cepas, se observó que entre las cepas nativas estos índices variaron, al presentar el DT con respecto al PSR una regresión moderadamente fuerte (r² = 25,29%) (fig. 6), aunque el índice de regresión fue relativamente débil (r²= 20,00%) en el PSA con respecto al PSR (fig. 7).

Estos resultados coinciden con la regresión encontrada en estas mismas variables, pero en plantas de trigo, al ser inoculadas con las cepas anteriormente señaladas en condiciones de invernadero (Bécquer et al., 2006). El índice de regresión en LT con respecto a PSR fue relativamente débil (r² = 14,5%), así como el correspondiente a PM con relación a PSR (fig. 8 y fig. 9, respectivamente).

También se halló un índice moderadamente fuerte (r²= 30,5%) entre la variable PSA con respecto a PSR (fig. 10) en el análisis de regresión para las cepas comerciales, y débil (r²= 1,6%) para LT (fig. 11), DT (r²= 1,8%) (fig. 12) y PM (r²= 22,0%) (fig. 13).

Estos resultados indican una débil dependencia de estas variables con respecto al desarrollo radicular, excepto en el diámetro del tallo (cepas nativas) y en el peso seco aéreo (cepas comerciales), donde se corroboró lo planteado por Lupwayi y Clayton (2004) acerca de que los rizobios pueden actuar como promotores del crecimiento vegetal y cambiar la fisiología y morfología de las raíces inoculadas, lo que resulta en una mayor absorción de N y otros nutrientes.

Es posible que al no evaluar algunos de los indicadores agroproductivos de la planta, no se haya podido determinar una relación o dependencia más definitoria entre las variables; aunque este aspecto, en opinión de los autores, no le resta calidad a la selección de las cepas. Se concluye que en las variables PSA, LT y DT existieron tratamientos que fueron estadísticamente superiores al control absoluto, y en el caso de la LT dos tratamientos presentaron valores sin diferencias significativas a los del control fertilizado. En el PSR los tratamientos inoculados fueron inferiores al control fertilizado, excepto JI2, TD1, SP7 y SP12.

No se detectaron diferencias estadísticas entre tratamientos en la PM. Se obtuvo una agrupación, en conglomerados, de los tratamientos inoculados que mostraron valores estadísticos superiores o inferiores, de acuerdo con las distintas variables, por lo que se efectuó una selección de aquellas cepas (TD₁, JK₆, SP₁₂, SP₇, TE₄, JK₁, SP₂₁, USDA 110, JI₂, JJ₆, USDA 76, SP₂₀, 25B6, SP₁₅, NITRAGIN, ATCC 10317) que se destacaron, para su posterior evaluación en condiciones de campo. Al evaluar todos los tratamientos en cuanto al grado de dependencia de las diferentes variables con respecto al PSR se determinó que, en general, el índice de regresión fue débil, pero al analizarlos por separado se observó una regresión fuerte en las variables DT (cepas nativas) y PSA (cepas comerciales). ]]> Se recomienda la continuación de estas investigaciones en condiciones de campo.

Agradecimientos

Al igual que en experimentos anteriores realizados con trigo, el financiamiento, así como las instalaciones, equipos y materiales utilizados para este trabajo, fueron provistos por Alberta Research Council (Vegreville, Alberta, Canadá), a través de un proyecto de colaboración con la Estación Experimental de Pastos y Forrajes Sancti Spíritus, Cuba. Los autores agradecen profundamente a todos los funcionarios de esta Institución canadiense, especialmente al Dr. Daniel Archambault y al Dr. Jan Slaski, por su gran esfuerzo en hacer realidad este proyecto.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Antoun, H.; Beauchamp, C.J.; Goussard, N.; Chabot, R. & Lalande, R. 1998. Potential of Rhizobium and Bradyrhizobium species as plant growth promoting rhizobacteria on nonlegumes: Effect on radishes (Rhaphanus sativus L.). Plant and Soil. 204:57

2. Antoun, H. & Kloepper, J.W. 2001. Plant growth promoting rhizobacteria. Encyclopedia of Genetics. (Brenner, S. and Miller, J.F., Eds.). Academic Press, New York. p. 1477

3. Antoun, H. & Prévost, D. 2000. PGPR activity of Rhizobium with nonleguminous plants. Proceedings of the 5^th International PGPR workshop. Villa Carlos Paz, Córdoba, Argentina. p .62

4. Bécquer, C.J. 2003. Caracterización y selección de rizobios adaptados a ecosistemas ganaderos de Sancti Spíritus, Cuba. Tesis en opción al grado científico de Doctor en Ciencias Biológicas. Universidad de La Habana. 140 p.

5. Bécquer, C.J.; Salas, Beatriz; Archambault, D.; Slaski, J. & Anyia, A. 2006. Inoculación de trigo (Triticum aestivum, L.) con rizobios adaptados a ecosistemas ganaderos de Sancti Spiritus, Cuba. Pastos y Forrajes. 29:255

6. Bécquer, C.J.; Salas, Beatriz; Archambault, D.; Slaski, J. & Anyia, A. 2008. Selección de rizobios adapta dos a ecosistemas ganaderos de Alberta, Canadá; inoculados en maíz (Zea mays, L.). Fase I: invernadero. Logro Científico del Instituto de Investigaciones de Pastos y Forrajes. La Habana, Cuba ]]> 7. Biswas, J.C.; Ladha, J.K. & Dazzo, F.B. 2000. Rhizobia inoculation improves nutrient uptake and growth of lowland rice. Soil Sc. Soc. of America J. 64:1644

8. Cocking, E.C. 2004. Endophytic colonization of plant roots by nitrogen fixing bacteria. Plant and Soil. 252:169

9. Lerch, G. 1976. La experimentación en las ciencias biológicas y agrícolas. Ed. Ciencia y Técnica. La Habana, Cuba. 452 p.

10. Lupwayi, N.Z. & Clayton, G.W. 2004. Endophytic rhizobia and other diazotrophic bacteria in nonlegume crops. Recent Res. Devel. Crop Sci. 1:227

11. Prévost, D.; Saddiki, S. & Antoun, H. 2000. Growth and mineral nutrition of corn inoculated with effective strains of Bradyrhizobium japonicum. Proceedings of the 5^th International PGPR workshop. Villa Carlos Paz, Córdoba, Argentina. 7 p.

12. Reddy, P.M.; Ladha, J.K.; So, R.B.; Hernández, R.J.;Ramos, M.C.; Ángeles, O.R.; Dazzo, F.B. & de Bruijn, F.J. 1997. Rhizobial communication with rice roots: Induction of phenotypic changes, mode of invasion and extent of colonization. Plant and Soil. 194:81

13. Sabry, S.R.S.; Saleh, S.A.; Batchelor, Caroline; Jones, J.; Jotham, J.; Webster, G.; Kothari, S.L.; Davey, M.R. & Cocking, E.C. 1997. Endophytic establishment of Azorhizobium caulinodans in wheat. Proc. R. Soc. Lond. B. 264:341 Somasegaran, P. & Hoben, H.J. 1994. Handbook for rhizobia. Springer-Verlag, New York. 450 p.

14. Yanni, Y.G. et al. 2001. The beneficial plant growth promoting association of Rhizobium leguminosarum bv. trifolii with rice roots. Australian Journal of Plant Physiology. 28 (9):845

15. Bécquer, C.J.; Salas, Beatriz; Archambault, D.; Slaski, J. & Anyia, A. 2008. Selección de rizobios adapta dos a ecosistemas ganaderos de Alberta, Canadá; inoculados en maíz (Zea mays, L.). Fase I: invernadero. Logro Científico del Instituto de Investigaciones de Pastos y Forrajes. La Habana, Cuba

Recibido el 28 de junio del 2007 ]]> Aceptado el 4 de marzo del 2008