Variabilidad intraespecífica de cepas de Phytophthora palmivora Butler (Butler) aisladas de plantaciones de aguacatero (Persea americana Mill.) en Cuba
Intraspecific variability of Phytophthora palmivora Butler (Butler) strains isolated from avocado (Persea americana Mill.) orchards on Cuba
IInstituto de Investigaciones de Fruticultura Tropical (IIFT). 7ma e/ 30 y 32, Miramar, Playa, CP 11300, La Habana, Cuba.
IICentro de Aplicaciones Tecnológicas y Desarrollo Nuclear. 5ta y 30, # 502, Miramar, Playa, La Habana, Cuba.
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RESUMEN
Se utilizaron en el estudio ocho cepas de Phytophthora palmivora Butler (Butler) obtenidas de jardines de aguacateros de la región occidental de Cuba, y se describieron los patrones de crecimientos de las colonias en medio agar papa dextrosa (PDA), agar zanahoria (AZ), agar jugo vegetal V8 (AV8) y agar malta (AM), así como los tipos de esporangios presentes. Se evaluó la variabilidad intraespecífica de los aislamientos en base a las dimensiones de los esporangios y de sus papilas. Las cepas mostraron un patrón de crecimiento de las colonias uniforme en cada uno de los cuatro medios de cultivo, aracnoide en los medios PDA y AM y estrellado en AV8 y AZ. Se observó una amplia diversidad en los tipos de esporangios, generalmente ovoides-elipsoides, obpiriformes, esféricos y distorsionados y con pedicelos cortos (2-5 µm), aspectos que se corresponden con la especie P. palmivora. Las dimensiones de los esporangios oscilaron entre 25 µm y 80 µm (promedio 48,8 µm ± 9,1 µm) de largo y 17,5 µm a 52,5 µm de ancho (promedio 31,8 µm ± 5,5 µm). Las papilas alcanzaron de 2,5 µm a 10 µm de largo (promedio 5,7 µm ± 1,7 µm) y entre 2 µm y 10 µm de ancho (promedio 6,5 µm ± 1,6 µm). El Análisis de Componentes Principales demostró la existencia de variabilidad en las dimensiones de los esporangios y las papilas, en base al largo y ancho de los esporangios, la relación largo/ancho de los mismos, el ancho de las papilas y la relación largo/ancho de las papilas.
Palabras clave: Phytophthora, esporangios, papilas.
ABSTRACT
The colony patterns were described for eight P. palmivora strains isolated from avocado orchards located in the western Cuban region, that were grown on potato dextrose agar (PDA), malt extract agar (AM), V8 agar (AV8) and carrot agar (AZ). The sporangia shapes observed in the P. palmivora strains were also described. The intraspecific variability was evaluated based on the size of sporangia and papillae. The strains showed a uniform colony pattern on each of the culture media used, arachnoid on PDA and AM media and stellate on AV8 and AZ media. A wide diversity of types of sporangia was observed, mostly ovoid-ellipsoid, obpyriform, spherical and distorted with short pedicels (2-5 µm). Sporangia shape ranged between 25 µm and 80 µm long (average 48,8 µm ± 9,1 µm) and 17,5 µm to 52,5 µm in breadth (average 31,8 µm ± 5,5 µm) with prominent papillae ranging from 2,5 µm to 10 µm long (average 5,7 µm ± 1,7 µm) and between 2 µm to 10 µm in breadth (average 6,5 ± 1,6 µm). The Principal Component Analysis showed a great variability considering both the sporangia and papillae sizes with the length and breadth of the sporangia and their ratio, the width and the length/breadth ratio of the papillae as the most variable characters.
Key words: Phytophthora, sporangia, papillae.
INTRODUCCIÓN ]]>
Phytophthora spp. afecta varias especies de frutales y provoca en ellas pudrición de raíces, cuello, tronco, ramas laterales y frutos. Los representantes de este género, con pocas excepciones, presentan una amplia gama de hospedantes, hasta 1996 se conocían 54 especies de Phytophthora (1), once años después se informaron aproximadamente 50 especies adicionales, la mayoría asociadas con la mortalidad de los árboles en ecosistemas de bosques (2) y se conoce que varias especies de este género pueden coexistir en una misma planta (3, 4).La pudrición de las raíces del aguacatero, constituye una de las enfermedades más comunes que afectan este frutal en Cuba (5), aunque poco se conoce de su incidencia y severidad, debido entre otras razones, a que no es un cultivo extensivo y no se priorizó en las investigaciones científicas.
El principal agente causal de la tristeza del aguacatero es Phytophthora cinnamomi Rands, no obstante, se informaron otras especies de Phytophthora (Phytophthora heveae Thompson, Phytophthora citricola Sawada y Phytophthora palmivora) como agentes causales del cancro del aguacate (6), enfermedad que afecta severamente el cultivo y cuya incidencia real en Cuba se desconoce, aunque se asoció a P. cinnamomi, Phytophthora nicotianae Van Breda de Hann (7) y a P. palmivora (8).
La información acerca de la diversidad genética de Phytophthora y variaciones en la patogenicidad entre poblaciones en diferentes regiones donde se explota comercialmente el aguacatero, resulta de utilidad para adoptar esquemas de manejo en esos agroecosistemas y para asistir al programa de mejoramiento genético como agente de selección.
El presente trabajo se propuso como objetivo evaluar la variabilidad intraespecífica a nivel morfológico de un grupo de cepas de P. palmivora obtenidas de plantaciones de aguacatero en Cuba.
Colección de cepas de P. palmivora utilizadas en el estudio
Para el estudio se utilizaron ocho cepas de P. palmivora (Tabla 1) pertenecientes a la colección del Instituto de Investigaciones en Fruticultura Tropical (Cuba), aisladas de plantaciones de aguacatero, que fueron previamente identificadas a nivel morfológico (8) y molecular (9).
Medios de cultivo utilizados ]]>
Las cepas fueron sembradas en placas Petri con cuatro medios de cultivo: medio agar-papa-dextrosa (Potato-Dextrose-Agar, PDA), agar zanahoria (AZ) (10), agar y jugo vegetal V8 (AV8) (1) y agar malta (AM). Se incubaron en la oscuridad, a la temperatura óptima para la mayoría de las especies de Phytophthora (24°C) durante 7 días, al cabo de los cuales se registró el tipo de colonia observado, de acuerdo con lo descrito (1).Producción de esporangios
Para la producción de esporangios en medio líquido se usó el método basado en retirar discos de micelio de 5 mm de diámetro, de los márgenes del cultivo del hongo previamente crecido en medio AZ durante 4 días y transferirlos a placas Petri de cristal que contenían medio líquido de zanahoria (2 ml de jugo de zanahoria y 8 ml de agua destilada estéril) (10). Estas placas se incubaron a 24°C bajo luz fluorescente continua (a una distancia de 40 cm de la lámpara), durante 24 horas. Transcurrido ese tiempo, el medio líquido de zanahoria fue retirado asépticamente y sustituido por 10 ml de agua destilada estéril. Posteriormente las placas se mantuvieron por 24 horas a 24°C bajo condición de luz continua.
Variables evaluadas
Las estructuras del hongo se localizaron y se prepararon para su observación al microscopio. Se realizaron las descripciones del tipo de esporangio y sus mediciones de largo, ancho y la relación largo/ancho (1), así como el largo y ancho de las papilas (10) y la relación largo/ancho de las mismas, estas mediciones se expresaron en µm. Se midieron 50 esporangios de cada aislado.
Las observaciones y mediciones se realizaron bajo un microscopio óptico Carl Zeiss de contraste de fase, modelo Axioskop 40 y utilizando un aumento de 400X. Se utilizó una cámara Cannon de 7.1 Mega Pixels con zoom óptico de 4X para fotografiar las estructuras evaluadas.
En las evaluaciones se incluyó, con fines comparativos, una cepa de P. palmivora (LRS75/01) aislada de papaya y gentilmente donada por el Dr. Eduardo Feichtenberger, del Instituto Biológico de Sorocaba, Brasil.
Procesamiento estadístico
Se realizó un Análisis de Componentes Principales (ACP) considerando las mediciones realizadas a las ocho cepas de P. palmivora e incluyendo la cepa adicional utilizada con fines comparativos. El ACP se realizó a partir de la matriz de correlaciones, utilizando el paquete de programas PAST versión 2.17 (11).
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RESULTADOS Y DISCUSIÓNDescripción de los patrones de crecimiento de las colonias, tipos de esporangios y sus dimensiones en los aislados de P. palmivora de aguacatero
Las cepas provenientes de aguacatero, mostraron un comportamiento uniforme en cuanto al patrón de crecimiento de las colonias de P. palmivora en cada uno de los cuatro medios de cultivo utilizados; aracnoide en los medios PDA y AM y estrellado en los medios AV8 y AZ, coincidiendo con lo informado previamente para esta especie (1,12).
El patrón cultural estrellado de las colonias fue el más común en un estudio de 89 aislados procedentes de 10 países diferentes, donde 49 de esos aislamientos de P. palmivora procedentes de cacao, crecieron en medio agar V8 en forma de estrella. No obstante, también se evidenció una alta variabilidad en cuanto al patrón de crecimiento de las colonias, tanto de los aislados que pertenecían a un mismo país como entre los que pertenecían a diferentes regiones geográficas (13). Similares resultados, en cuanto a la prevalencia de este patrón de crecimiento de las colonias, fueron informados para aislados de P. palmivora de cocotero (14).
La longitud y ancho de los esporangios de los aislamientos estudiados se presentan en la Tabla 2. Los esporangios fueron variables en su forma, desde ovoides y elipsoides, obpiriformes, esféricos y distorsionados con bases redondeadas (Fig. 1), con papilas prominentes y pedicelos cortos (2-5 mm). Estos valores fueron similares a los informados para aislados de P. palmivora obtenidos de cacao (13) y palma de aceite (15,16). Los valores de las dimensiones de los esporangios se corresponden con el rango informado inicialmente para P. palmivora (1) y confirman la identificación inicial de los mismos, basado en marcadores morfológicos (12).
Estos elementos resultan de importancia para futuros trabajos de diagnóstico de aislamientos de este patógeno en Cuba, al constituirse en una colección de referencia para el trabajo con este fitopatógeno. Hoy se acepta que, a pesar del desarrollo alcanzado por las herramientas moleculares, las que pueden responder a muchas interrogantes taxonómicas, el muestreo de los suelos para el aislamiento de patógenos y el mantenimiento de colecciones de referencia de cultivos vivos continúa siendo una tarea crucial (17).
De igual modo, el estudio representa la base para el desarrollo de ulteriores estudios de caracterización patogénica y de la posible correlación de estas variables con los resultados de la caracterización molecular efectuada a los mismos (9).
Evaluación de la variabilidad de aislados de P. palmivora
El ACP realizado a partir de las dimensiones de los esporangios y de las papilas mostró que las tres primeras componentes principales explicaron el 96,52% de la variabilidad total. La primera componente principal explicó el 44,42% de la variabilidad con la mayor contribución de las variables ancho de los esporangios (Aesp), relación largo/ancho de los esporangios (L/Aesp), relación largo y ancho de las papilas (L/Apap); mientras que, la segunda componente principal, explicó el 34,9% de la variabilidad total, a partir de la mayor contribución de las variables largo de los esporangios (Lesp), nuevamente la relación largo y ancho de las papilas (L/Apap) y el ancho de las papilas (Apap) (Tabla 3). ]]>
Un primer resultado que se observa a partir de la representación gráfica del biplot es que las dos primeras componentes principales muestran una amplia dispersión de las cepas cubanas estudiadas, incluido el aislado LRS75/01 que se utilizó con fines comparativos. Esta distribución indica la existencia de variabilidad en las dimensiones de los esporangios y las papilas entre las cepas de P. palmivora colectados en plantaciones de aguacatero. En este sentido a lo largo de la primera componente se localizan las cepas: IIFT-161 a la extrema izquierda caracterizada por presentar los mayores valores de la variable ancho de los esporangios (Aesp) y los menores en cuanto a la relación largo/ancho de los esporangios (L/Aesp);mientras que, de manera contraria se ubicó el aislado IIFT-150 el cual presenta el mayor valor en la relación largo/ancho de los esporangios (L/Aesp) los esporangios mas estrechos (Aesp) (Fig. 2).
Con relación a la segunda componente principal, el aislado IIFT-151 se ubicó en el extremo superior de la misma, cerca del aislado incluido con fines comparativos LRS75/01, por presentar ambos los mayores valores para el largo de las esporangios (Lesp) y los menores para la relación largo/ancho de las papilas (L/Apap). De manera opuesta se ubicaron los aislados IIFT-127, IIFT-165 e IIFT-160 que de forma general presentaron los menores valores para el largo de los esporangios (Lesp). Por último, cerca del centro de coordenadas se encuentra el aislado IIFT-166 y muy cerca la cepa IIFT-149, los cuales presentaron valores promedios para las variables evaluadas (Fig. 2, Tabla 2).
Los resultados alcanzados en este estudio demostraron la existencia de variación significativa en la envergadura de los esporangios y sus papilas entre cepas de P. palmivora, los que resultan similares a los obtenidos en aislados de cacao y demuestran nuevamente las dificultades que existen en la identificación certera sobre la base solamente de datos morfológicos (13).
Los estudios de diversidad en microorganismos patógenos resultan de gran importancia para el mejoramiento genético vegetal. La alta diversidad de aislamientos de P. infestan puede provocar la ruptura de la resistencia en cultivares de papa (18), por lo que las estrategias en la búsqueda de genes de resistencia en interacciones específicas han cobrado actualidad con ejemplos concretos en papa - P. infestan (19, 20), que incluyó la creación de la bases de datos para explorar genes de resistencia (21); así como, en la interacción tomate - P. infestans, en fresa-P. fragariae Hickman y en la interacción soya-P. sojae (20, 22).
Estos enfoques relacionados con la búsqueda de genes de resistencia comenzaron a utilizarse recientemente en aguacatero criollo mexicano (P. americana var. drymifolia) aunque en este caso para el control de P. cinnamomi (23).
La información derivada de este trabajo sirve de base para la realización de estudios similares a los mencionados anteriormente relacionados con la detección de posibles genes de resistencia en la interacción P. palmivora y patrones de aguacatero en Cuba, así como en estudios epidemiológicos, teniendo en cuenta el amplio rango de hospedantes que posee esta especie de Phytophthora y los peligros que representa la actual tendencia de los productores hacia la diversificación de las plantaciones.
La alta variabilidad morfológica detectada indica la necesidad de profundizar en los estudios futuros de caracterización taxonómica mediante herramientas moleculares. De igual forma, resultará imprescindible la conservación de estos aislados para posteriores investigaciones de interacción planta-patógeno y la asistencia al programa de mejoramiento biotecnológico de patrones de aguacatero que ejecuta el IIFT en colaboración con el CEADEN.
Este trabajo fue financiado parcialmente por los proyectos CITMA 00300260 y 00300339 y por los proyectos internacionales del Organismo Internacional de la Energía Atómica (OIEA): Contrato de Investigación No. 11671 y ARCAL 056. ]]>
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Recibido: 16-7-2012. ]]> Aceptado: 10-12-2012.
*Autor por correspondencia: O. Coto. Instituto de Investigaciones de Fruticultura Tropical (IIFT). 7ma e/ 30 y 32, Miramar, Playa, C. Habana, Cuba, Código Postal 11300. Correo electrónico: orlando_coto@yahoo.com. ]]>
