ARTÍCULO ORIGINAL

Yanisia Duarte Leal,^I Anayza Echevarría Hernández,^II Benedicto Martínez Coca,^I

^ICentro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA), Apartado 10, San José de las Lajas, CP 32 700, Mayabeque, Cuba. ]]> ^IIUnidad Científico Tecnológica de Base Los Palacios (UCTB-LP), Pinar del Río; Instituto Nacional de Ciencias Agrícola (INCA), Cuba.

INTRODUCCIÓN

El garbanzo (Cicer arietinum L.) es la segunda leguminosa de grano de importancia en el mundo (1); sin embargo, las producciones en Cuba, hasta los años 90, no fueron de consideración y, en consecuencia, no aparecen registros estadísticos del cultivo. Debido a ello, para satisfacer el consumo interno, fue necesario realizar importaciones provenientes, mayoritariamente, de México, Canadá y España (2).

El incremento de las áreas en el cultivo del garbanzo en Cuba se logró gracias a la introducción de cultivares que responden a las condiciones del país, así como al conocimiento cada vez mayor del cultivo, el aumento de los precios en la comercialización y  los bajos costos de producción con relación a otras especies de granos, por lo que constituye un rubro atractivo para su producción (3). Por otro lado, este cultivo es poco exigente al  agua y puede cosecharse en condiciones de sequía severa. Esto constituye un valioso aporte en el empeño de Cuba por sustituir importaciones de alimentos muy costosos en el mercado internacional (4).

Las enfermedades representan una de las causas en la disminución de los rendimientos en el cultivo; entre las más importantes en Cuba y el mundo, se encuentran las ocasionadas por hongos del suelo, como son: Fusarium spp., Sclerotium rolfsii Sacc., Rhizoctonia solani Kühn, Macrophomina phaseolina (Tassi)  Goid; sin embargo,  por los daños que producen, y la frecuencia con que se presentan, Fusarium spp. son los de mayor significación (5).

Las fusariosis aparecen, principalmente, en los suelos arcillosos o con problemas de drenaje, condición que favorece el desarrollo de estas patologías (6). En la India y Pakistán, el 15% de las cosechas se afectan anualmente por Fusarium. Estos hongos también provocan pérdidas en México y España; en la Cuenca del Mediterráneo y California la enfermedad devastó el cultivo por completo en condiciones favorables para su desarrollo (7).

En las fusariosis en el cultivo se integran diferentes síndromes, denominados Marchitez vascular y Amarillez vascular, que son ocasionados por Fusarium oxysporum Schlechtend.: Fr. f. sp. ciceri (Padwik) Matuo & K. Sato (Foc) (8), y el complejo de síntomas designado como “Marchitez y Podredumbre de Raíz” (MPR), que se asocia con infecciones causadas por diversos hongos de suelo, incluyendo F. oxysporum f. sp. ciceri, Fusarium solani (Mart.) Appl. & Wr. f. sp. pisi (Jones) Snyd & Hans.,Fusarium solani f. sp. eumartii (C. Carpenter)W.C. Snyder & H.N. Hans. (=Fusarium eumartii Carpenter), M. phaseolina (1) y Fusarium redolens Wollenw (9). Estos síndromes son consecuencia de infecciones vasculares en la planta infectada (10, 11).

El sídrome MPR provoca un amarillamiento prematuro de las hojas basales, se relaciona con necrosis en la raíz principal y estrangulamiento a nivel del cuello (10). Sin embargo, F. redolens ocasiona amarillamiento foliar acrópeto y necrosis radical (9).

En Cuba,  Dueñas et al. (12) caracterizaron especies de Fusarium que afectaron al garbanzo en las antiguas provincias Ciudad Habana y La Habana, identificadas como F. oxysporum f. sp. ciceri y F. solani. No obstante, la información  acerca de las especies de Fusarium en este cultivo en el país es aún  escasa.

La investigación se efectuó en el Laboratorio de Micología Vegetal perteneciente al grupo de Fitopatología del Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA), en el municipio San José de las Lajas, provincia Mayabeque, Cuba.

Aislamiento del agente causal

Se muestrearon plantas de diferentes líneas de garbanzo, que presentaron síntomas típicos de marchitez, con necrosis y amarillamiento y que crecían en  suelo Hidromórfico Gley Nodular Ferruginoso,  en la Unidad Científico Tecnológica de Base Los Palacios (UCTB-LP), provincia Pinar del Río, perteneciente al Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA), Cuba. Las muestras de plantas con diferentes síntomas y otras, aparentemente sanas, se trasladaron en sobres de papel Kraft, previamente esterilizados, al Laboratorio de Micología Vegetal.

Además, se analizaron semillas con afectaciones (deformaciones, reducción del tamaño y/o decoloración) provenientes de la primera obtención de semillas de Siria e INIFAT (Cuba). Estas  se lavaron con abundante agua corriente durante 20 min, se desinfectaron con alcohol (70%) por 45 s y se lavaron tres veces en agua destilada estéril; después se trataron con una solución de hipoclorito de sodio (1%), se enjuagaron tres veces en agua destilada estéril y se secaron con papel absorbente estéril. Posteriormente, se colocaron  grupos de cuatro semillas en cámaras húmedas (placas Petri de 150 mm de diámetro con papel de filtro esterilizado humedecido). Las semillas se observaron diariamente, hasta la aparición de estructuras fúngicas. Se observaron fragmentos de estas al microscopio óptico Zeiss (200x) para corroborar la presencia de Fusarium.

Por otro lado, a las muestras de raíces necrosadas y/o tallos con estrangulamiento en la base, se les realizaron cortes longitudinales y se seccionaron en fragmentos de 10×20mm asépticamente; se procesaron de igual forma que las semillas.

Los fragmentos de micelio, que se obtuvieron de semillas y de tallos, se sembraron en placas Petri (Ø=90 mm) con medio Papa Dextrosa Agar (PDA) (Biocen) más cloranfenicol (0,01g.L^-1) y se incubaron a 28ºC± 2ºC y oscuridad constante. Se observaron los fragmentos de micelios de los aislados obtenidos en un microscopio óptico Zeiss (200x) para confirmar su identidad con el género Fusarium.

Las colonias de los aislados analizados se purificaron mediante siembras en el mismo medio, hasta la obtención de cultivos puros que, posteriormente, se transfirieron a tubos de ensayos con medio PDA (Biocen) en forma de cuña y se incubaron como se describió anteriormente, por diez días. Los aislados se conservaron a 4ºC en el cepario del Laboratorio de Micología Vegetal del CENSA.

A los tubos contentivos de los aislados, desarrollados durante siete días en cuñas de PDA (Biocen), se les añadieron 10 ml de agua destilada estéril y se homogeneizaron en agitador Vortex por 30 s. Con un asa bacteriológica desinfectada, se tomó una asada de la suspensión y se depositó en el centro de placas (Ø=90mm) que contenían cinco ml de medio de cultivo Agar agua (2%) y se dispersó con una espátula de Drigalsky. Todas las placas se sellaron con papel parafilm y se incubaron a 28ºC±2ºC y oscuridad constante, durante 24 h. Se hicieron tres réplicas por aislamiento.

Después de este periodo, bajo un microscopio óptico Zeiss (200x), se detectaron y señalaron conidios solitarios germinados por el reverso de la placa, con un marcador de punta fina. Con una aguja de siembra flameada se transfirió el fragmento de agar, donde se encontraba un conidio germinado marcado a una placa Petri con medio de cultivo PDA (Biocen) más cloranfenicol (0,01%). Las placas se sellaron con parafilm e incubaron a 28ºC±2ºC durante siete días. Una vez que se lograron los cultivos puros monospóricos, se conservaron a 4ºC en tubos de ensayo con cuñas del propio medio de cultivo en el Laboratorio de Micología Vegetal del CENSA.

El inóculo se preparó bajo condiciones asépticas, a partir de cultivos de los aislamientos monospóricos sembrados en tubos con cuñas de PDA (Biocen) e incubados a 28ºC±2ºC y oscuridad durante siete días. A los tubos con los aislados se les adicionaron 10 ml de agua destilada estéril y se homogeneizaron en agitador Vortex durante un minuto. Las suspensiones obtenidas se ajustaron a la concentración de 10⁶ conidios.ml^-1 para cada aislamiento, con la adición de agua destilada estéril; la concentración se determinó en una cámara de Thoma.

Se tomaron fragmentos cuadrados de papel Kraft y se depositaron 100 g de suelo, se doblaron a la mitad y se enrollaron. Se colocaron en frascos de cristal y se esterilizaron a 121ºC durante 30 minutos. Posteriormente, bajo condiciones asépticas, sobre el suelo esterilizado se depositaron, en línea, diez semillas de garbanzo cultivar 5HA, previamente desinfectadas [con alcohol al 70% (45 s) e hipoclorito de sodio al 10% (2 min) y tres enjuagues con agua destilada estéril]. A continuación, con ayuda de una pipeta estéril, se le aplicaron 20 ml de la suspensión de cada aislamiento independientemente, al suelo y a las semillas. El papel, con el suelo y las semillas inoculadas, se enrolló, se envolvió en papel aluminio esterilizado y se depositó verticalmente en un recipiente de cristal que contenía 10 ml de agua destilada estéril en el fondo. El testigo (semillas desinfectadas en suelo estéril con la adición de 20 ml de agua estéril sin la inoculación del patógeno) se procesó de igual forma que los tratamientos con los aislamientos de Fusarium. Los recipientes con los rollos de papel se incubaron a temperatura ambiente (30ºC ±2ºC) en un local en condiciones asépticas.

Los tratamientos se examinaron diariamente, hasta la brotación de las plántulas (aproximadamente siete-diez días). De las plantas afectadas se hicieron aislamientos del agente causal, según se describió anteriormente, y se compararon las características de la colonia (color, forma, textura), así como de las estructuras fúngicas del reaislamiento con las del aislado respectivo que se utilizó como inóculo.

Se evaluaron los síntomas ocasionados por los aislados en las plantas y se seleccionaron los aislamientos más agresivos sobre la base de la cantidad de plantas afectadas.

La caracterización cultural de los aislamientos de Fusarium spp. se realizó sobre la base de caracteres cualitativos y cuantitativos, expresados por los aislamientos sobre los medios de cultivo PDA (Biocen), Czapek Dox (CzD) (Fluka) y Leonian (13).

La coloración de la colonia en el anverso y reverso se determinó por observación visual y se documentó mediante fotografías tomadas con una cámara Olympus. También se describieron la textura superficial, forma de los bordes y presencia de anillos en el anverso. Se midió el crecimiento lineal (diámetro promedio de la colonia sobre la base del crecimiento horizontal en dos diagonales perpendiculares, expresado en milímetros por día), con una regla graduada.

A partir del crecimiento lineal, se calculó la velocidad de crecimiento al séptimo día de incubación, empleando la fórmula siguiente:

Donde:

V crec f= Velocidad de crecimiento final al completar el área de la placa (en mm.h^-1).

Dc= Diámetro de las colonias (en mm)

t = Tiempo hasta siete días o momento en que la colonia completará el área total de la placa (en h)

El conteo de esporas se realizó a los siete días de crecimiento de las colonias de cada aislamiento en los medios de cultivo. A las placas con los cultivos desarrollados se les adicionaron 15 ml de agua destilada estéril y se homogeneizaron con una espátula de Drigalsky. Las esporas se colectaron en un tubo de ensayo por réplica. Las suspensiones se homogeneizaron en agitador Vortex por 30 s y se depositaron gotas de estas (de cada aislamiento por separado), en una cámara de Neubauer para determinar la concentración de conidios. Se compararon los resultados según la cantidad de conidios por área de la colonia.

Los aislamientos se sembraron en tres medios de cultivo, según la clave referida por Leslie y Summerell (14), para la identificación de aislamientos de Fusarium: hojas de clavel agar [Carnation Leaf-piece Agar (CLA)], PDA y Spezieller Nährstoffarmer Agar (SNA). Se utilizaron placas Petri de 90 mm de diámetro, contentivas de 15 ml de cada medio de cultivo por separado (esterilizados a 121^oC por 15 min y pH 6). El medio de cultivo CLA se elaboró al verter en cada placa 15 ml de Agar agua estéril; seguidamente se depositaron fragmentos (seis-siete) de hojas de clavel de 3-5 mm², previamente esterilizadas.

Las placas se inocularon central e individualmente con cada aislamiento de Fusarium; se sellaron eincubaron a 28ºC±2ºC y oscuridad constante durante cinco días. Se utilizaron tres réplicas por cada aislamiento.

Aspectos taxonómicos evaluados en cada medio

En el medio de cultivo CLA, se visualizaron al microscopio óptico Zeiss (400x) los macroconidios, células conidiógenas y microconidios (presencia y disposición). Además, se realizaron preparaciones microscópicas de cada aislamiento para observar la forma y el tamaño de los macroconidios, septos en los microconidios y determinar la disposición de las clamidosporas.

En el medio PDA se hicieron las observaciones para determinar la pigmentación, la forma y la velocidad del crecimiento de las colonias, la formación de esporodoquios y el número de septos en los macroconidios; mientras que en el SNA se observó la presencia de clamidosporas y forma de microconidios y macroconidios.

Las muestras de plantas con diferentes síntomas presentaron pudrición negro-rojiza en la raíz principal, que abarcó hasta las raíces secundarias, con estrangulamiento a nivel del cuello. La necrosis se extendió hasta la parte superior del tallo y las ramas. Se observó un cambio de color, de verde oscuro a verde pálido en las hojas de la parte superior de las plantas enfermas, con  flacidez de arriba hacia abajo y concluyó con la marchitez de la planta. En las plantas con síntomas avanzados, apareció una clorosis amarillo opaco en la parte inferior de la planta. Este síntoma se detectó en una o más ramas, avanzó de abajo hacia arriba hasta quedar la planta completamente amarilla y ocasionarle la muerte. Estos síntomas se describen por diferentes autores de forma independiente (8, 10) y pudieran ser asociados con diferentes agentes causales.

De semillas aparentemente sanas y de otras afectadas con deformaciones, reducción del tamaño y/o decoloración, se aislaron hongos pertenecientes a los géneros Fusarium spp. y Aspergillus spp.; sin embargo, más del 70% de los aislamientos correspondieron al primer género. Esto corrobora lo informado por Aguaysol et al. (15) y García et al. (16): el agente causal de la marchitez en este cultivo puede ser diseminado por semilla. De ahí, la importancia de obtener semillas de calidad y de realizar tratamientos de desinfección de las mismas.

Todos los aislamientos de Fusarium examinados mostraron patogenicidad, reprodujeron parte de los síntomas típicos de Fusariosis, necrosis en la raíz, marchitez en la parte aérea de la planta joven, semejantes a los notificados para F. solani (17). Los síntomas en la raíz comenzaron con una decoloración externa del tejido que se tornó café-rojizo, al igual que en el tejido vascular, similares a los descritos para F. oxysporum f. sp. ciceri (10). Las lesiones no presentaron un margen definido y ocasionaron grietas longitudinales en la raíz, que se agrandaron y tornaron color café oscuro (11).

De los reaislamientos realizados, a partir de los síntomas procedentes de las inoculaciones artificiales, se obtuvieron aislamientos con características culturales y morfométricas similares a las de los inoculados, con lo que se comprobaron los postulados de Koch. La incidencia de la enfermedad dependió del aislado;  se destacaron los aislamientos 8, 12 y 13 (Tabla 1) con el 100% de plantas infectadas.

Caracterización cultural y morfométrica de los aislamientos de Fusarium spp.

En las colonias de los aislamientos sembrados en medio PDA se observó gran variabilidad, cuyas coloraciones variaron desde violáceo a ligeramente amarillenta, de blanquecino a rojo ladrillo, a lila, a violeta, a rosa salmón; además, tomaron coloraciones rojo violáceo y rojo vino (Fig. 1). Estos resultados coinciden con los informados por Villanueva et al. (18) sobre la existencia de algunas especies de Fusarium que pueden presentar, en medios de cultivo sintético, colonias blancas, cremas, naranjas, pardo, pardo-rojizo, rojo carmín, rosa, púrpura e incluso azuladas. Esta pigmentación puede estar dada por la coloración del micelio o por la difusión de algún pigmento en el medio de cultivo en el cual se desarrolla el hongo. Resultados similares notificaron Arvayo et al. (19), al informar variaciones en la coloración de las colonias de F. oxysporum en medio de cultivo PDA, desde blanquecino, parduzco-blanco, rosáceo-blanco y púrpura-parduzco.

La mayoría de los aislados presentó colonias con bordes ondulados y regulares, con textura afelpada lobulada (Fig. 1).

En el medio de cultivo Leonian, la totalidad de los aislamientos desarrollaron colonias de diferentes tonalidades con predominio del amarillo, excepto los aislados 2, 4 y 7 que presentaron tonalidades rojo-violáceas. Los bordes, en su mayoría, fueron regulares y redondeados; la textura rala y radial (Fig. 2).

En el medio CzD, los aislados mostraron colonias con diferentes tonalidades de amarillo, combinadas con blanco y, en algunos casos, con salmón (aislados 6 y 10). Los bordes de las colonias en su mayoría fueron redondeados y regulares, y la textura algodonosa (Fig. 3).

Las colonias de varios aislamientos formaron anillos en los diferentes medios de cultivo; en PDA, los aislados 1, 4, 7, 8 y 12; en Leonian, 6, 7, 10 y 14; y el 2 en CzD, lo que evidencia la influencia del medio de cultivo en la formación de anillos, aspecto que reafirma la variabilidad existente entre los aislamientos.

Aun cuando los aislamientos 8 y 9 proceden de semillas de diferentes líneas genéticas (Tabla 1) y presentan diferencias en la formación de anillos en PDA y de sectores en medio Leonian, mostraron similitud en la textura y la coloración de la colonia en los tres medios, por lo que podrían ser entes de una misma especie.

Sobre la base de los resultados, el medio PDA es idóneo para estudios de caracterización cultural de los aislados de Fusarium spp. de garbanzo, debido a la amplia variabilidad cultural que se puede observar en los aislamientos.

La velocidad de crecimiento fue significativamente mayor en el medio CzD, independientemente de los aislados analizados (Tabla 2). Los aislamientos 6 y 10 mostraron el crecimiento más rápido en los medios de cultivo PDA y CzD; se destacan en medio CzD, cuya velocidad de crecimiento fue de 0,63 mm.h^-1.Los aislamientos 1, 4, 8, 9, 12 y 15 mostraron la velocidad más alta en medio de cultivo Leonian. Los aislamientos que alcanzaron la máxima velocidad en los medios, evidencian una asimilación diferencial de los compuestos nutritivos, lo que pudiera ser motivo de una mayor colonización de estos en diferentes tipos de suelo. Lo anterior  muestra la existencia de variabilidad entre estos aislamientos (Tabla 2).

Estos resultados coincidieron con lo informado por Dueñas et al. (12) acerca de que los aislamientos de Fusarium procedentes de garbanzo son de rápido crecimiento, entre 0,30-0,54 mm.h^-1 en medio PDA, y con lo notificado por Lezcano et al. (20) para F. oxysporum procedente de Leucaena leucocephala (Lam.) de Wit cv. Perú, que mostró  una velocidad de crecimiento de 0,38 mm.h^-1 en este mismo medio. La  alta velocidad de crecimiento de los aislados de Fusarium procedentes de garbanzo pudiera estar directamente relacionada con la colonización del suelo, aspecto que se debe esclarecer en investigaciones futuras.

Por otro lado, aunque los aislamientos esporularon en todos los medios de cultivo, este proceso se favoreció en medio PDA, con diferencias significativas con la obtenida en los medios CzD y Leonian. También, en este medio (PDA) se observó mayor variación en la esporulación entre los aislamientos  (Tabla 3).

Los aislados 3 y 9 mostraron la mayor producción de conidios en medio PDA. Sin embargo, los aislados 6 y 10 (en Leonian) y 4, 5 y 16 (en CzD) mostraron las menores producciones de conidios (Tabla 3).

En el medio PDA se obtuvo el menor crecimiento general; sin embargo, aseguró la mayor esporulación por área de los aislamientos de Fusarium. Esto tiene interés para la obtención de inóculos con diferentes fines como las pruebas de patogenicidad, las pruebas de resistencia y la conservación de cultivos, entre otros. 

Los 16 aislamientos de Fusarium mostraron gran variabilidad en todos los caracteres analizados. Por otro lado, los aislados 5, 8 y 9 presentaron el 100 % de plantas infectadas, pero no se ubican entre los más destacados respecto al crecimiento y la esporulación; lo que sugiere que estos caracteres cualitativos no presentaron estrecha relación con la patogenicidad de los mismos.

De forma general, esta variabilidad tiene importancia para la identificación de especies, así como para la determinación de presencia de biotipos en el patógeno.

Resultados similares para F. oxysporum y F. solani se notificaron  por Dueñas et al. (12) y Jiménez et al. (10), los cuales coinciden con las características presentadas para estas especies.

De los aislamientos obtenidos se determinaron, por sus características morfoculturales, seis especies de Fusarium (F. oxysporum f. sp. ciceri, F. solani, F. proliferatum, F. nygamai, F. phyllophilum, F. dlamini), causantes de la fusariosis del garbanzo en áreas de Pinar del Río; las cuatro últimas notificadas por primera vez en el cultivo para Cuba. En este aspecto se profundizará mediante la utilización de técnicas moleculares. 

Estos resultados tienen importancia para el programa de selección de cultivares y para la evaluación de estos, así como para el manejo de la enfermedad. Adicionalmente, se detectó variabilidad entre aislamientos de una misma especie, lo que sugiere la posible existencia  de biotipos, aspectos en los que se debe profundizar en estudios posteriores. Todo ello refleja la intensa evolución que está sucediendo en el género Fusarium y la variedad de especies capaces de afectar al cultivo de garbanzo en el occidente de Cuba.

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