Normalización y validación de ensayos inmunoenzimáticos para cuantificar IgG humana antileptospira serovares canicola canicola, icterohaemorrhagiae copenhageni y pomona mozdok.

Standardization and validation of immunoenzimatic assays for the quantitative determination of human IgG-class antibodies to leptospira canicola canicola, icterohaemorrhagiae copenhageni and pomona mozdok

Xenia Ferriol, Rolando Ochoa, Yoandra Rodríguez, Ana Margarita García, Martha González, Juan Carlos Martínez, Eric Estrada, Rosa Blanco, Franklin Sotolongo.

Instituto Finlay. Centro de Investigación-Producción de Vacunas y Sueros. Ciudad de La Habana, Cuba. ]]> E-mail:xferriol@finlay.edu.cu

RESUMEN

Con el objetivo de evaluar la respuesta inmune inducida por la vacuna cubana vax-SPIRAL se desarrollaron tres ELISAs de tipo indirecto para la cuantificación de IgG humana antileptospira, en el cual se emplearon como antígenos de captura las células enteras de Leptospira interrogans de los serovares canicola canicola, icterohaemorrhagiae copenhageni y pomona mozdok, inactivadas con formaldehído y posteriormente desecadas a 33 °C durante 16-20 h en placas para ELISA. Para la cuantificación se empleó un suero estándar al que se le asignaron unidades arbitrarias, correspondientes al recíproco del título obtenido por microaglutinación (MAT). Estos fueron 31, 12 y 58 U/mL respectivamente para los tres serovares señalados que se incluyen en el preparado vacunal. Se utilizó un conjugado anti IgG humana-peroxidasa, el cual se une a los anticuerpos específicos contra cada serovar, la reacción se evidencia por la acción de la enzima sobre la mezcla sustratocromógeno (ortofenilendiamina) que genera color. El método normalizado se validó para los tres serovares; la precisión intra e interensayos fueron excelentes, con coeficientes de variación inferiores al 10%. Las desviaciones de la recuperación y linealidad fueron también inferiores al 10%. El suero control se ubicaron para los tres serovares en la zona de mayor interés para las muestras. Los ELISAs mostraron un 100% de sensibilidad para los tres serovares y se obtuvieron valores de 93,33% de especificidad para los serovares canicola canicola e icterohaemorrhagiae copenagheni y de 100% para el serovar pomona mozdok. El límite de detección para cada uno de los serovares fue de 0,478; 0,127 y 0,632 U/mL respectivamente.

Palabras claves: Leptospira, validación, ELISA, vax-SPIRAL

ABSTRACT

Indirect ELISAs for the quantitative determination of human IgG-class antibodies to leptospira were developed for the evaluation of the immune response elicited by vax-SPIRAL. Whole cells of Leptospira interrogans, serovars canicola canicola, icterohaemorrhagiae copenhageni and pomona mozdok were used as capture antigens. The formaldehydeinactivated cells were dried at 33 °C between 16-20 hours on ELISA plates. The units of the standard serum were assigned according the inverted microagglutination tittles, and were 31, 12 and 58 U/mL respectively. An anti-human IgG class / HRPO conjugate was employed for the detection of antibodies to leptospira, then the chromogenic substrate (H2O2-orthophenilendiamine) is hydrolyzed by the enzyme of the conjugate, and the intensity of the color is proportional to the antibody concentration in the sample. The intra and interassay precision studies achieved variation coefficients below 10%. The deviations of the recovery and linearity tests were below 10% also. The control serum was located according the samples. The sensitivity was 100% for all serovars, and the specificity was 93,33% for the serovars canicola
canicola and icterohaemorrhagiae copenhageni, and 100 % for pomona mozdok. The detection limits were 0.478, 0,127 and 0,632 U/mL respectively.

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