Neisseria meningitidis carriers, characterization of isolated strains and basal immune response to VA-MENGOC-BC
María J. Valdés1, Isabel Martínez2, Gustavo Sierra2, María A. Camaraza2, Iván Cuevas2, Mayelin Mirabal2, Pedro Rodríguez2, Yadira Fuentes3, Graciela Bolaños2, Isabel Villasusa1.
1. Escuela Latinoamericana de Medicina (ELAM). Carretera Panamericana Km 3 1/2. Santa Fé, Playa. Ciudad de La Habana, Cuba.
2. Instituto Finlay. Centro de Investigación-Producción de Vacunas. Ave.27 No. 19805. La Lisa. Ciudad de La Habana, Cuba.
3. Hospital Docente Clínico Quirúrgico "Joaquín Albarrán". Ciudad de La Habana, Cuba.
Correo electrónico: mjuliavh@elacm.sld.cu
RESUMEN
Con el propósito de conocer la prevalencia de portadores de Neisseria meningitidis en un grupo de adolescentes, los marcadores epidemiológicos de las cepas aisladas, así como los factores de riesgo asociados con el estado de portador y la respuesta inmune basal a VA-MENGOC-BC , se realizó un estudio transversal descriptivo de portadores en 189 estudiantes de 12-19 años de un politécnico de Ciego de Ávila, siguiendo las Normas Bioéticas establecidas. A los estudiantes se les realizó un exudado faríngeo y una extracción de sangre para la obtención de suero, así como una encuesta relacionada con aspectos de la investigación. La identificación de N. meningitidis se hizo por el sistema API NH (bioMérieux). Los serosubtipos e inmunotipos se clasificaron por ELISA de células enteras con anticuerpos monoclonales y la respuesta inmune basal se detectó por el Ensayo Bactericida del Suero. Se determinó la susceptibilidad antimicrobiana de las cepas frente a la penicilina, cloranfenicol, rifampicina, sulfadiacina sódica, ceftriaxona y ciprofloxacina. La prevalencia de portadores de N. meningitidis fue del 17%. Predominaron las cepas no agrupables (84,7%), seguidas por los serogrupos B (12,5%) y Z (3,1%), destacándose la ausencia del C. Prevaleció el fenotipo NA:NT:P1.NST:L3,7,9 (12,5%), las cepas resistentes a la sulfadiacina (78,2%) y sensibles a penicilina (81,3%), aunque el 18,7% mostró sensibilidad intermedia a este fármaco. Al resto de los antimicrobianos todas fueron sensibles. Se constató una respuesta inmune de memoria a la vacuna antimeningocócica (VAMENGOC-BC®), 12 años después de su aplicación, con títulos bactericidas anti C y B de 25 y 42%, respectivamente, resultados que pudieran estar influenciados por la inmunización sistemática que se realiza en Cuba con esta vacuna desde 1991. ]]>
Palabras clave: Neisseria meningitidis, portadores, memoria inmunológica, ensayo bactericida del suero, susceptibilidad antimicrobiana.
ABSTRACT
A descriptive transversal study of N. meningitidis carriers involving 189 students of 12-19 years old of a Polytechnic School in Ciego de Avila province was carried out. This study aimed at knowing the prevalence of N. meningitidis carriers , the epidemiological markers as well as risk factors associated to carrier state and to basal immune response to VA-MENGOC-BC in teenagers. Blood sample and pharyngeal swab tests were carried out to the students, in addition a survey was performed to find out aspects of research. Identification of N. meningitidis was carried out by API NH system (bioMérieux). Sero-subtypes and immunotypes were classified by whole cell ELISA with monoclonal antibodies, and basal immune response was detected by Serum Bactericidal Assay (SBA). Antimicrobial susceptibility of strains to Penicillin, Chloramphenicol, Rifampicin, Sodic Sulfadiazine, Ceftriaxone and Ciprofloxacine was determined. Prevalence of N. meningitidis was 17%. Non groupable strains were predominant (84.7%), followed by serogroups B (12.5%) and Z (3.1%), serogroup C was absent. Phenotype NA:NT:P1.NST:L3.7.9 (12.5%) prevailed, resistant strains to sulfadiazine (78.2%) and sensitive to penicillin (81.3%), though 18.7% showed intermediate sensitivity to this drug. All strains were sensitive to the remaining antimicrobial drugs. Memory immune response to meningococcal vaccine (VA-MENGOC-BC ) was observed , 12 years after its application, with anti C and B bactericidal titers of 25 and 42% respectively. We consider that these results may be influenced by systematic immunization that is carried out with this vaccine in Cuba since 1991.
Keywords: Neisseria meningitidis, carriers, immunologic memory, Serum Bactericidal Assay, antimicrobial susceptibility.
Introducción
La enfermedad meningocócica (EM), entidad clínica ocasionada por Neisseria meningitidis, constituye un importante problema de salud en diversas regiones del mundo. Esta enfermedad, que afecta principalmente a los niños y adolescentes, muestra en algunos casos una evolución fulminante, elevada morbimortalidad, así como la capacidad de producir brotes o epidemias, propiedades que la mantienen como un tema de constante actualidad (1). Su agente etiológico, N. meningitidis, es un patógeno exclusivo del hombre que coloniza la nasofaringe y permanece en ella sin ocasionar, en la mayoría de los casos, síntomas ni signos clínicos evidentes de infección, estableciéndose así el denominado estado de portador (2). Por ser el hombre su único reservorio natural, la infección se transmite por el contacto directo, estrecho y prolongado con las secreciones respiratorias del sujeto infectado, lo que explica porqué en los colectivos cerrados existe una mayor probabilidad de contagio y un aumento significativo del índice de portadores (1, 2). Las investigaciones sobre la condición del portador de N. meningitidis y su prevalencia en diferentes grupos poblacionales contribuyen de manera significativa a una mejor comprensión sobre la patogenia y la epidemiología de esta entidad clínica. ]]>
Cuba, país que padeció una epidemia severa de EM durante la década de los años 80, exhibe en estos momentos una tasa de incidencia muy baja (0,2/100 000 habitantes) (3), cifra inferior a la notificada en la etapa preepidémica y que experimentó una disminución evidente luego de la incorporación de VA-MENGOC-BC® al Programa Nacional de Inmunizaciones en 1991, razón que justifica la realización de estudios encaminados a conocer la prevalencia de portadores y las características de las cepas de N. meningitidis aisladas. Los resultados obtenidos con este tipo de estudio son de gran utilidad para la prevención y el control de la EM. Paralelamente, para un país que logró la obtención de una vacuna antimeningocócica, capaz de disminuir la incidencia de los casos invasivos a cifras muy bajas, sería de especial interés conocer el estado inmunológico de la población, trabajos que permitirán monitorear y evaluar el impacto de VA-MENGOC-BC® en la población inmunizada y sobre el estado de portador de N. meningitidis.
Materiales y Métodos
En el año 2000 se realizó un estudio transversal descriptivo de portadores de N. meningitidis en adolescentes, con edades comprendidas entre los 12 a 19 años, de un politécnico de oficios de la provincia de Ciego de Ávila. En su diseño se tuvieron en cuenta las exigencias bioéticas y regulatorias nacionales e internacionales establecidas para este tipo de estudio.
Universo de trabajo y muestra
Entre los 523 adolescentes se seleccionó al azar la tercera parte de los alumnos distribuidos en los 21 grupos existentes en ese centro docente, tomando en cuenta que los estudiantes compartían el mismo dormitorio, aunque por no tener los grupos un número homogéneo de alumnos la muestra seleccionada fue de 189 estudiantes. Los mismos llenaron una encuesta confeccionada previamente, donde se indagó sobre los factores de riesgo (edad, sexo, hábito de fumar, régimen de internado y antecedentes de infección respiratoria aguda reciente) que pudieran influir en la condición del estado de portador de N. meningitidis.
El exudado faríngeo se realizó en la escuela durante la mañana, empleando un depresor lingual estéril. La muestra se tomó con hisopo de algodón estéril y se inoculó directamente en placas de Petri con Agar Mueller Hinton (Merck), enriquecido con suero fetal bovino al 5% (Hyclon) y un complejo inhibidor compuesto por vancomicina, colistina y nistatina (VCN) (bioMérieux). Las placas inoculadas se trasladaron, en un tiempo menor a las 2 h, al Laboratorio de Microbiología, lugar donde se estriaron e incubaron (24-48 h) a 37 ºC y atmósfera húmeda con 5-10% de CO2.
Identificación y confirmación del crecimiento bacteriano
La identificación de las cepas de N. meningitidis se realizó mediante el sistema comercial API NH (bioMérieux) y para su seroagrupamiento se empleó la técnica de aglutinación en láminas con antisueros comerciales: A, B, C, X, Y, Z, W135 (Difco). Mientras que la determinación de los serotipos, subtipos e inmunotipos se realizó por un ensayo inmunoenzimático (ELISA) de células enteras con anticuerpos monoclonales (AcM), según el protocolo descrito por Abdillahi y Poolman (4), modificado en el Instituto Finlay (5). Para la determinación de los serotipos y subtipos se utilizó un panel comercial de AcM del Instituto Nacional de Investigaciones para el Hombre y el Ambiente de Holanda (RIVM, por sus siglas en inglés), panel con seis AcM de serotipos y 13 de subtipos. Además, se empleó el AcM P1.19, donado por el Instituto Nacional para Control Biológico y Estándares del Reino Unido (NIBSC, por sus siglas en inglés), centro que también proporcionó los AcM para la identificación de los inmunotipos: L3,7,9, L8 y L10.
Para las técnicas realizadas se emplearon cepas controles, todas pertenecientes al Departamento de Colecciones de Cultivo del Instituto Finlay.
Determinación de la susceptibilidad a los antimicrobianos
]]> Para el estudio de la susceptibilidad antimicrobiana se siguieron las normas recomendadas por el Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) de los Estados Unidos (M100-S15) (6), empleándose el método de dilución en Agar Mueller-Hinton suplementado con 5% de sangre de carnero. Se investigaron los siguientes antimicrobianos: penicilina, ceftriaxona, cloranfenicol, rifampicina, ciprofloxacina y sulfadiacina sódica. El inóculo final de todas las cepas fue de 104-105 UFC y sus rangos de dilución fueron: penicilina y rifampicina (0,004-2 g/mL); ceftriaxona (0,002-1 g/mL); ciprofloxacina (0,002-1 g/mL); cloranfenicol (0,063-16 g/mL) y sulfadiacina sódica (1, 5, 10, 25, 50 y 100 g/mL); aunque para este último fármaco no se le añadió sangre al medio de Agar Mueller Hinton. La siembra se realizó con la ayuda de un multirreplicador (Steer), incluyéndose placas controles sin antimicrobianos. Los cultivos se incubaron durante 24 h a la temperatura de 37 0C y una atmósfera húmeda con 5-10% de CO2. La lectura y comparación de los resultados se realizó de forma manual, interpretándose como CMI la menor concentración del antimicrobiano capaz de inhibir el crecimiento de N. meningitidis. Se emplearon las categorías de sensible (S), sensibilidad intermedia (SI) y resistente (R), según los rangos de CMI establecidos por CLSI (2005). Los rangos de corte se muestran a continuación:Agente antimicrobiano Criterios CLSI (µg/mL)
S SI R
Penicilina (Merck) 0,06 0,12-0,25 0,5
Sulfadiacina sódica
(SIGMA) 1 10 25
Rifampicina (Merck) 0,5 1 2
Cloranfenicol (Merck) 2 4 8
Ciprofloxacina (Merck) 0,03 0,06 0,12 ]]>
Ceftriaxona (SIGMA) 0,12 - -
Se usaron como controles las cepas de Staphylococcus aureus ATCC 29213 y Escherichia coli ATCC 25922.
Toma de muestra de sangre y determinación de la respuesta inmune basal contra N. meningitidis B y C
Se realizó una extracción de sangre por vía intravenosa mediante el uso de jeringuillas estériles desechables (10 mL). La sangre se centrifugó para obtener el suero y este se mantuvo a -20 0C hasta el momento de la realización del Ensayo Bactericida del Suero (EBS). Debido a la contaminación de algunos sueros, el total de las muestras estudiadas para la determinación de la respuesta inmune contra B fue de 184 sueros y 178 para el serogrupo C.
Cepas utilizadas en el EBS y metodología empleada
Se emplearon las cepas homólogas de N. meningitidis 385/83 (B:4:P1.19.15) y C11 ATCC y los lotes de trabajo conservados en el medio Greaves a -70 0C. Se aplicó el método recomendado por el Centro para el Control de Enfermedades de Atlanta (CDC) (7).
Lectura e interpretación de los resultados del EBS
Mediante el uso de un microscopio estereoscópico se realizó el conteo de las colonias en todos los pocillos de la placa y se consideró como indicativo de actividad bactericida en el suero aquellas diluciones donde se observó un crecimiento de colonias igual o menor al 50%, con respecto al número promedio de colonias del control correspondiente a la suspensión bacteriana. El resultado se reportó en título de anticuerpos con relación al recíproco de la dilución del suero: Título Bactericida (TB).
]]> Análisis y procesamiento estadístico de los resultadosEl análisis estadístico se realizó usando el paquete S, implementación R, versión 2.1.1 y para todas las comparaciones se usó un nivel de significación del 5%. Se emplearon estadígrafos descriptivos para la edad de los participantes. Se construyeron tablas de frecuencia, que en conjunto con la prueba Chi-cuadrado o la prueba exacta de Fisher, permitieron evaluar las posibles relaciones entre las diversas variables y el estado de portador. Para las variables que recogen los títulos de anticuerpos se calculó la media geométrica.
Resultados
De los 189 estudiantes seleccionados, 32 (17%) fueron portadores de N. meningitidis. Aunque no se observó diferencia estadísticamente significativa respecto al total de portadores del sexo femenino y masculino, prevalecieron los portadores de N. meningitidis entre las adolescentes del grupo de 15 años (76,5%), mientras que en los varones el mayor porcentaje se observó en los estudiantes de 16 años (40%). Al relacionar el resto de los factores de riesgo investigados (hábito de fumar, régimen de internado y antecedentes de infección respiratoria aguda reciente) con el estado de portador, no se observaron diferencias estadísticamente significativas (p 0,05).
La caracterización fenotípica de las cepas aisladas se describe en la Tabla 1. Predominaron las cepas no agrupables (NA) (84,4%), seguidas por el serogrupo B (12,5%) y Z (3,1%). Entre los serotipos prevalecieron los no tipables (NT) (53,1%), seguidos por el 15 y el 4, ambos con porcentajes similares (21,9%) y un aislamiento correspondió al serotipo 1 (3,1%). Los subtipos mostraron una mayor diversidad, prevaleciendo las cepas no subtipables (NST) (31,2%) y P1.5 (15,6%). Predominó el inmunotipo L3,7,9 (71,9%).
Tabla 1.
Leyenda: NA = No agrupable; NT = No tipable; NST = No subtipable; NIT = No inmunotipable
]]>
Figura 1.
La Tabla 2 muestra los resultados de la actividad bactericida del suero. Doce años después de la inmunización con VA-MENGO-BC®, el 42 y 25% de los estudiantes exhibieron títulos de anticuerpos bactericidas frente a las cepas B y C, respectivamente. El comportamiento de portadores y no portadores con relación a la actividad bactericida del suero no mostró resultados significativos.
Discusión
El número de portadores de N. meningitidis identificados en este estudio mostró para este grupo de edades cifras similares a las descritas por otros autores, coincidiendo así con los trabajos que señalan porcentajes de portadores elevados entre los adolescentes y adultos jóvenes (10-35%) (8, 9). No obstante, otros notifican cifras inferiores (11,3% y 1,4%) (10, 11). Sin embargo, un estudio realizado en jóvenes universitarios señala una cifra más elevada (32%) (12), resultado quizás favorecido por tratarse de estudiantes de una academia militar, población sometida a condiciones de vida que propician una mayor interacción social, tales como: el hacinamiento, las maniobras, acampadas y movilizaciones, actividades que incrementan la transmisión de cepas de N. meningitidis entre estos individuos.
Aunque no se observó diferencias estadísticamente significativas cuando se relacionó el estado de portador con la edad y el sexo, el ligero predominio de portadores en el sexo femenino coincidió con el resultado descrito por Davies y colaboradores, al estudiar 119 contactos de adolescentes de un caso índice de EM (13). No obstante, numerosos trabajos refieren un mayor número de portadores de N. meningitidis entre los varones (14, 15), situación que pudiera quizás estar influenciada por los numerosos estudios realizados en localidades cerradas o semicerradas, sitios donde suele prevalecer la población masculina.
La exposición pasiva y activa al humo del tabaco constituye una de las variables más involucrada con el estado de portador de meningococo debido a los efectos perjudiciales que se le atribuye al humo sobre la acción ciliar de las células de la mucosa respiratoria (16, 17, 18). No obstante, coincidiendo con este estudio, trabajos realizados en diferentes regiones tampoco señalan asociación entre ambas variables (12, 19, 20). El resultado obtenido en este trabajo pudo estar influenciado por la población investigada, grupo de individuos muy jóvenes y con poco tiempo de exposición al tabaco.
]]> El hacinamiento se asocia también al estado de portador y son numerosas las investigaciones que aseveran esta condición, sobre todo aquellas vinculadas con las poblaciones militares o grupos que conviven en regímenes de internado o seminternado (21, 22). Aunque, en este estudio no se observó diferencias significativas al comparar la condición de alumno interno con el estado de portador de meningococo, está bien documentado que los portadores nasofaríngeos de bacterias potencialmente patógenas y que habitan en instituciones cerradas, aumentan en más de un 50%, propiciándose así una mayor transmisión de estos microorganismos (23).Algunos autores refieren que las infecciones respiratorias agudas (IRA), principalmente las de etiología viral, predisponen a la colonización nasofaríngea por bacterias patógenas (22, 24). Sin embargo, la evidencia que ejerzan efectos importantes en la adquisición de N. meningitidis resulta compleja, así lo expresan los estudios realizados en África y la India durante un período invernal, época caracterizada por el aumento de las IRA, donde contrariamente a lo esperado no detectaron un aumento del índice de portadores (2).
Las características fenotípicas de las cepas aisladas en este estudio difieren del patrón mostrado por las cepas aisladas durante la epidemia de EM en Cuba, etapa donde existió un evidente predominio del fenotipo B:4:P1.19,15:L:3,7,9 (25). Sin embargo, las asociaciones fenotípicas de este trabajo mostraron un comportamiento similar a los obtenidos en los estudios de portadores realizados en Cuba durante los últimos años, resaltándose la gran variabilidad de las cepas (12, 26), resultado que coincide con aquellos que señalan una mayor diversidad entre los aislamientos de portadores (27, 28). El predominio de las cepas NA en este trabajo y la ausencia del serogrupo C, hablan a favor del impacto logrado por la inmunización sistemática con VA-MENGO-BC® desde 1991, comportamiento que se hace más evidente debido al escaso número de cepas virulentas identificadas.
La resistencia a la sulfadiacina constituye una situación reconocida mundialmente. Estudios similares realizados en Cuba (29) y en otras regiones (19, 30) confirman la persistencia de esta resistencia y justifican su abandono como quimioprofiláctico. Sin embargo, la rifampicina mantiene su vigencia y constituye el fármaco de elección en Cuba y otros países, pero se observa una tendencia a la emergencia de cepas resistentes, sobre todo después de su empleo en la prevención de casos secundarios de EM (31).
Al igual que otros trabajos realizados en Cuba (32), en este estudio todas las cepas fueron sensibles al cloranfenicol. Sin embargo, en Francia y Vietnam se detectan meningococos resistentes a este antimicrobiano, alertándose del aumento de cepas de N. meningitidis con características similares (33, 34).
En este trabajo se constató la eficacia de la ceftriaxona, coincidiendo así con lo descrito por otros autores, los que manifiestan su utilidad para el tratamiento de los casos invasivos de EM, demostrando también su efectividad para erradicar el estado de portador (35). Por otro lado, la ciprofloxacina, fármaco del grupo de las quinolonas, constituye una buena alternativa como quimioprofiláctico, sin embargo, recientemente se han encontrado en Argentina cepas con SI (36), comportamiento que pudiera estar relacionado con la presión selectiva ejercida por el uso indiscriminado del mismo en las infecciones de la comunidad (31).
Desde hace algunos años, el fenómeno de la SI a la penicilina se ha convertido en un problema para las autoridades de salud. Otros trabajos realizados en Cuba señalan una situación similar a la del presente estudio (26, 37). En España la emergencia de cepas de N. meningitidis con SI a la penicilina se identificó desde 1985, situación que aumenta también en varios países y llega a considerarse como un problema terapéutico de gran envergadura (19, 31, 35).
Cuando se analizó la respuesta inmune basal por EBS, el suero de un número considerable de estudiantes mostró anticuerpos bactericidas contra ambas cepas vacunales 12 años después de inmunizados, comportamiento que puede estar relacionado con una respuesta inmune de larga duración inducida por VA-MENGO-BC® y reforzada por la exposición de manera repetida e intermitente a otras cepas de meningococo que inducen la formación de anticuerpos homólogos y heterólogos. No debe descartarse el hecho de que esta inmunidad se refuerza por la exposición a bacterias que no tienen relación taxonómica con N. meningitidis, pero que comparten con ella epítopes semejantes e inducen anticuerpos con reactividad cruzada. Se señala que N. lactámica induce la formación de anticuerpos bactericidas contra meningococo, protegiendo así de la infección meningocócica (38).
Se puede concluir que, para comprender mejor la transmisión de cepas de N. meningitidis dentro de la comunidad se deben seguir realizando estudios similares, trabajos que incorporen otros grupos poblacionales y métodos diagnósticos que contribuyan a una mejor identificación de las cepas. El conocimiento de los marcadores epidemiológicos de las cepas de N. meningitidis aisladas de enfermos y portadores, así como la respuesta inmune a este microorganismo, constituyen estudios indispensables en la vigilancia epidemiológica de la EM. Identificar los fenotipos y la susceptibilidad a los antimicrobianos de las cepas circulantes aporta una valiosa información para analizar adecuadamente el alcance de las acciones de Salud Pública y posibilitar la toma de decisiones sobre futuras intervenciones basadas en datos científicos.
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Aceptado: Julio de 2008
