Lic. María Julia Martínez,1 Lic. Marisol López,2 Dr. José Betancourt Badell,3 Dr. Héctor Barceló Pérez,4 Lic. María Elena Montes4 y Dra. Rosaura Regó5
El estudio toxicológico preclínico se realizó con hojas secas de Psidium guajava L. A este material vegetal se le efectuó un estudio toxicológico agudo por 2 métodos: 1) dosis letal media LD50 en ratones suizos (OF1) y 2) toxicología alternativa (clases tóxicas agudas) en ratas Wistar. También se realizó la evaluación genotóxica de 2 extractos, uno acuoso y otro hexánico en un sistema in vitro de ensayo de inducción de segregación somática a corto plazo en el hongo Aspergillus nidulans, y un ensayo in vivo de la droga seca en el test de inducción de micronúcleos en médula ósea de ratón. Los resultados toxicológicos no arrojaron muertes en ninguno de los 2 modelos experimentales en el rango de dosis empleando hasta 2 000 mg/kg/p.c. y los resultados histológicos no sugieren daños atribuibles a toxicidad del material vegetal probado. En el estudio in vitro con Aspergillus nidulans D-30, los resultados demuestran la ausencia de efecto genotóxico de estos extractos, así como en el sistema de inducción de micronúcleos en médula ósea de ratón.
DeCs: EXTRACTOS VEGETALES/toxicidad; EXTRACTOS VEGETALES/efectos adversos; PLANTAS MEDICINALES; ANIMALES DE LABORATORIO; ASPERGILLUS NIDULANS; TESTS DE MICRONUCLEUS; TESTS DE MUTAGENICIDAD.
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This toxicologic study was conducted using dry leaves of Psidium guajava L. In this plant material we performed an acute toxicologic study by 2 methods: 1) mean lethal dose LD50 test in Swiss mice (OF1) and 2) alternative toxicology (acute toxic classes) in Wistar rats. We also made the genotoxic assesment of 2 extracts, one of aqueous type, and the other of henaxic type in an in vitro system of short-term somatic segregation induction assay in the Aspergillus nidulans fungus and an in vivo assay of the dry drug in mouse bone marrow micronuclei induction test. No deaths were observed in the toxocological results of the 2 experimental models in the dose range using up to 2 000 mg/kg/b.w. The histological results did not suggest any damage attributable to toxicity of the studied plant material. In the in vitro study with Aspergillus nidulans D-30, it was observed the lack of genotoxic effect of these extracts, as well as in the mouse bone marrow micronucelus induction system.
Subject headings: PLANT EXTRACTS/toxicity; PLANT EXTRACTS/adverse effects; PLANTS, MEDICINAL; ANIMALS, LABORATORY; ASPERGILLUS NIDULANS; MICRONUCLEUS TESTS; MUTAGENICITY TESTS.
La guayaba (Psidium guajava L.) de la familia Myrta-ceace es un arbusto que crece silvestre en toda Cuba y es originaria de América tropical.1 Entre sus componentes químicos se encuentra la vitamina C2 que es muy abundante en los frutos, en las hojas hay flavonoides como quercetina, aviculatina y guaijaverina a los que se les atribuye el efecto antimicrobiano.3
En medicina tradicional es empleado frecuentemente para tratar diarreas agudas y cólicos intestinales.1-7
Los estudios farmacológicos preclínicos han demostrado su efecto antimicrobiano sobre patógenos gastrointestinales2,4-7 que incluye un efecto antigiardiásico,8 contra diferentes gérmenes Gram positivo y negativo2 y otros microorganismos como los dermatofitos.9
Existen reportes en la literatura del efecto antimutagénico en el sistema de ensayos de Salmonella typhimurium10 aunque son escasos los estudios toxicológicos publicados.
Para probar la toxicidad de compuestos químicos bien definidos o de mezclas complejas se emplean animales de laboratorio que pueden ser roedores o no. Es oportuno señalar que los estudios de toxicidad aguda no son un sinónimo de mortalidad porque incluyen la evaluación de signos asociados a manifestaciones de toxicidad aguda y retardada, así como los posibles órganos diana del daño. Estas investigaciones generalmente se diseñan para determinar la potencia de tóxicos en términos de DL50 (dosis letal media) o CL50 (concentración letal media) y para detectar los efectos biológicos adversos durante un corto período de tiempo, causado por una dosis única o repartida en 24 h de un agente determinado11,12
La introducción de un nuevo método toxicológico alternativo, las clases tóxicas agudas (CTA), tiene como objetivo fundamental determinar los posibles efectos adversos de una sustancia para estimar la relación cuantitativa entre la intensidad de la respuesta biológica medible y la concentración del agente administrativo. A través de este método se reduce el número de animales de experimentación.13
El ensayo de segregación mitótica en el ascomiceto Aspergillus nidulans es un ensayo microbiano in vitro que detecta el incremento en la segregación de marcadores cromosomales durante la mitosis que puede ser resultado tanto de la inducción primaria por agentes físicos o químicos de entrecruzamiento mitótico y/o mala segregación cromosómica, como de la manifestación de eventos secundarios subsiguientes a la ocurrencia de daños clastogénicos que causen desequilibrio cromosomal.14 ]]>
El ensayo de inducción de micronúcleos (MN) en médula ósea de ratón es una prueba in vivo ampliamente validada y que permite detectar agentes que causan tanto rupturas cromosómicas y cromatídicas como pérdidas de cromosomas completos, al afectar el uso mitótico. En ambos casos, la migración y distribución incorrecta de una parte del material genético durante la anafase y telofase, conduce a la formación de micronúcleos, que pueden identificarse fácilmente en eritrocitos jóvenes (PCE) de la médula ósea.15
Se emplean hojas secas molidas de Psidium guajava L. Registrado con el número L. Sp.P1. 470,1753 que constituyen la materia prima (droga) del medicamento herbario CLAUDEN (cápsulas 500 mg)16 que fue suministrado por cortesía de los laboratorios C.I.T.S.A. de C.V., Edo. De México.
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Los estudios de toxicidad aguda y test de inducción de micronúcleos se realizaron en ratones suizos (OF1) (18 - 25 g) y la toxicología alternativa en ratas Wistar (180 - 200 g) procedentes del Centro Nacional de Producción de Animales de Laboratorio (CENPALAB). Los animales fueron adaptados a las condiciones de el vivario durante una semana previa a los experimentos. Durante todo el tiempo del ensayo tuvieron libre acceso al agua y al alimento que fue pienso de igual suministrador.
Los animales recibieron por vía oral, mediante sonda orogástrica, en dosis única de 250, 500, 1 000 y 2 000 mg/kg/p.c. de material vegetal. Se realizó un control negativo con carboximetilcelulosa 1 % y un control espontáneo. El número de animales fue de 10 por grupo y tenían 5 de cada sexo. Los grupos fueron formados mediante una selección aleatoria de los animales.11
Se administró 2 000 mg/kg/p.c. de material vegetal en aplicación única oral, a través de sonda orogástrica, a las ratas. El número de animales fue de 10 por dosis con 3 de cada sexo. La conformación de los grupos fue realizada aleatoriamente.13
En ambos experimentos, los animales se observaron con la periodicidad establecida en cada método hasta completar los 15 d posteriores a la administración del material vegetal o la correspondiente sustancia de control; la finalidad era determinar mortalidad y signos de otros efectos tóxicos. ]]>
Se tomaron al azar 2 animales, uno de cada sexo, por grupo experimental. Ellos fueron sacrificados por dislocación cervical y a continuación se les realizó una laparotomía para extraer los órganos a examinar (esófago, estómago, intestino delgado, hígado, riñón y cerebro) los cuales fueron fijados en formol al 10 % durante 72 h. Posteriormente se incluyeron en parafina se tomaron 3 cortes de cada bloque, se colorearon con hematoxilinaeosina y se realizaron las observaciones por microscopía óptica.
Genotixicidad in vitro
El extracto acuosos fue preparado según Xue-Jun y otros.17 Para ello se pesó 30 g de la droga, se le añadió 300 mL de agua destilada y durante 1 h permaneció la mezcla en reposo. A continuación se hizo hervir por 90 min, fue filtrado y restituido el volumen inicial con agua destilada estéril. La concentración final determinada de sólidos totales del extracto fue 12,73 mg/mL. ]]>
Para preparar el extracto hexánico17 también se pesó 30 g de droga, se le añadió 300 mL de hexano (Fluka,RA), se agitó y dejó macerar protegido de la luz durante 10 d. Al concluir este tiempo, se filtró, el extracto obtenido fue evaporado a presión reducida y los sólidos fueron resuspendidos en 10 ml etanol absoluto (Fluka, RA ) para dar una concentración final de sólidos totales en el extracto de 53,00 mg/mL.
En el ensayo se empleó medio de cultivo completo para Aspergillus nidulans como fue descrito por Scott y Kafer.18
Se utilizó la cepa Aspergillus nidulans D-30 que fue obtenida a partir de los haploides 593 (a) y 594 (b) procedentes del Fungal Stock Genetic Center. USA. La citada cepa es portadora de 4 mutaciones recesivas para el color de los conidios en condición heterocigótica. En las colonias que crecen expuestas a un agente genotóxico los marcadores se segregan en hemi u homocigosis una vez alcanzada la condición de haploide, con la consiguiente aparición de sectores coloreados sobre un fondo de conidios verdes (salvajes). Además, esta cepa contiene marcadores del metabolismo de azúcares, resistencia y auxotrofia que permiten establecer y corroborar adicionalmente la identidad del evento genético responsable de las alteraciones observadas en la segregación somática.
Ensayo de toxicidad19
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Para evaluar la toxicidad de los extractos se prepararon grupos de 4 placas a cada concentración mediante el método de incorporación en placa. Se sembraron conidios de la cepa en el centro de cada placa que se incubaron durante 72 h a 37,0 ± 0,1 oC. El experimento fue repetido 2 veces.Al concluir el tiempo de incubación, se determinó la reducción de las colonias y se hicieron 2 mediciones perpendiculares entre sí a el diámetro de cada una de ellas y se calculó el índice de toxicidad (IT).
Diámetro promedio de la concentración analizada, 100 %
IT = 100 _ ___________________________________
Diámetro promedio del control negativo
También se consideró la morfología de las colonias y el color y aspecto de la conidiación para rechazar aquellas concentraciones que pudieran afectar la visualización de los sectores segregantes.
El criterio de toxicidad tomado fue descrito por Kappas14: ]]>
IT = 1 _ 15 % Baja
IT = 16 _ 30 % Media
IT > 30 % Alta
Una vez realizado este experimento se selecciona un rango de concentraciones cuya toxicidad no afecte la visualización de los sectores segregantes para realizar el experimento de genotoxicidad. Para el extracto acuoso se trabajaron 5 concentraciones comprendidas entre 0,0012 y 1,273 mg/mL de medio de cultivo y para el extracto hexánico se trabajaron 3 concentraciones: 0,053; 0,265; 0,53 mg/mL de medio de cultivo.
El estudio con ambos extractos se realizó sembrando la cepa en el centro de 14 placas por cada concentración, las cuales fueron incubadas durante 6 d a igual temperatura que en el experimento anterior. A continuación se contó el número de sectores con colores claramente diferenciables del correspondiente diploide (verde-amarillo) que constituye el fondo de coloración normal. Se repitió el experimento 2 veces. Se compararon valores obtenidos para cada concentración de extracto con los del control negativo y se calculó para cada dosis o concentración del respectivo extracto la frecuencia de sectores por colonia (FSC) (De la torre RA, Determinación de actividad genotóxica con Aspergillus nidulans Tesis de Doctorado, La Habana. 1989).
Además, se estimó el índice de segregación mitótica, que consiste en el cociente de la frecuencia de sectores por colonia para cada dosis, entre la obtenida en el caso del control negativo. Se considera que un incremento superior a 2 veces en el valor del índice denota actividad genotóxica. ]]>
Se utilizó un control espontáneo y otro positivo con metilmetano sulfonato (MMS) para el experimento con el extracto acuoso. Mientras que para el extracto hexánico se empleó un control espontáneo, uno negativo con etanol al 1 % y otro positivo con MMS.
Se preparó un esquema de trabajo de 6 grupos de 10 animales: 5 hembras y 5 machos. Las dosis de Psidium guajava L. se seleccionaron sobre la base del estudio previo de toxicidad aguda, en el cual a la dosis de 2 000 mg/kg p.c. no se reportaron muertes ni signos de toxicidad. Teniendo en cuen-ta lo antes expuesto, las dosis fueron de 2 000, 1 000 y 500 mg/kg. p.c./d, un control negativo Carboximetilcelulosa (1 %), solvente con el cual fue suspendido el polvo de las cápsulas de Psidium guajava L., control positivo (ciclo-fosfamida 20 mg/kg p.c./d Asta Werke, Bielefeld, RDA) y un control espontáneo (agua destilada estéril). La Administración fue por vía oral, mediante sonda intragástrica como lo indica su uso terapéutico, en un volumen equivalente, al 1 % de su peso corporal.
El esquema de tratamiento consistió en 2 administraciones separadas por un intervalo de 24 h, después de la última aplicación a las 24 h siguientes, se procedió al sacrificio por dislocación cervical.20
Las muestras de médula ósea obtenidas se recogieron en suero de ternero sin calostro, se fijaron con etanol al 95 % durante 5 min y secaron al aire durante 24 h. Finalmente se tiñeron durante 20 min, con una solución de Gienmsa (ClinD, Empresa de Producción Biológicas. C. J. Finlay) al 5 % (V/V) en agua corriente.15 Se contaron los micronúcleos al menos en 2 000 eritrocitos policromáticos (PCE) para determinar el por ciento de micronúcleos en eritrocitos poli-cromáticos (% m PCE) y así la genotoxicidad y los eritrocitos normocromáticos (NCE) por cada 250 PCE, para determinar el indicador de citotoxicidad (IT). Los micronúcleos (MN) se identificaron según lo recomendado en The collaborative . Study Group of the Micromucleus Test. 21
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Los datos primarios obtenidos con el test de A. nidulans fueron normalizados aplicando la transformación Öx+0,5 a los valores segregantes de cada colonia analizada y se les aplicó un anova de una vía y clasificación simple.22Para la evaluación estadística en el test de micronúcleos los valores del IT y el % de PCE micronucleados se normalizaron empleando la transformación Ö(x+1). Los valores transformados se procesaron a través de un análisis de varianza de 2 vías, teniendo en cuenta el sexo y los tratamientos ensayados.23
No se registró en ninguno de los métodos toxicológicos muertes u otras manifestaciones de signos de efectos adversos.
Los estudios histopatológicos tanto en las ratas como en los ratones analizados al azar, mostraron un ligero edema cerebral, en los riñones tumefacción celular ligera del epitelio tubular, el hígado presentó degeneración vascular ligera y el intestino delgado un escaso infiltrado inflamatorio linfo-monocitario en mucosa con escasez de eosinófilos. Se debe reflejar que en los grupos controles se encontraron similares resultados.
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En la tabla 1 se muestran los resultados tanto del ensayo de toxicidad como de genotoxicidad para este extracto de Psidium guajava L. Sobre la cepa de Aspergillus nidulans D-30. Se pudo observar que no produjo efectos tóxicos ni genotóxicos en las concentraciones estudiadas.Tabla 1. Resultados del ensayo de segregación mitótica en Aspergillus Nidulans D-30 con un extracto acuoso de Psidium guajava L.
| Concentración | Toxicidad Colonias (n) | Diámetro (mm) | a IT (%) | Genotoxicidad Colonias (n) | Sectores segregantes | b FSC |
| Control (frecuencia espontánea) | ]]> 8 | 45,6 | - | 26 | 64 | 2,46 |
|
Extracto acuoso de P. guajava L. (mg/mL de medio de cultivo) | ]]> | |||||
|
• 0,0012 | 8 | 45,4 | 0,4 | 28 | ]]> 67 | 2,39 |
|
• 0,012 | 8 | 45,2 | 0,8 | 27 | 75 | 2,77 |
| ]]>
• 0,127 | 8 | 45,4 | 0,4 | 28 | 83 | 2,96 |
|
• 0,636 | ]]> 8 | 45,9 | -0,6 | 28 | 72 | 2,57 |
|
•1,273 | 8 | 46,0 | ]]> -0,8 | 28 | 81 | 2,89 |
|
Control positivo MMS (2,4 mM)c |
8 | 25,2 | ]]> 44,0 | 27 | 187 | 6,92 |
a Índice de toxicidad
b Frecuencia de segregantes por colonia
c Metilmetanosulfonato
Este extracto provocó una toxicidad media a la concentración de 0,53 mg/mL de sólidos totales en el medio de cultivo según el criterio establecido por Kappas14,24 y no mostró genotoxicidad en ninguna de las concentraciones utilizadas para el ensayo.
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Genotoxicidad in vivo
En el ensayo de inducción de micronúcleos en médula ósea de ratón. La tabla 3 demuestra que no existen diferencias significativas en el índice de citotoxicidad medular dada por la relación PCE/NCE, en cuanto al sexo (p = 0,75), dosis (p = 0,84) e interacción sexo x dosis (p = 0,86 ). La frecuencia de inducción de micronúcleos (% m PCE) no presentó tampoco diferencias significativas para el sexo) p = 0,38), dosis (p = 0,71) y la interacción sexo-dosis (p = 0,70).
Tabla 2. Resultados del ensayo de segregación mitótica en Aspergillus Nidulans D-30 con un extracto hexánico de Psidium guajava L.
| Concentración |
Toxicidad Colonias (n) | Diámetro (mm) | a IT (%) | Genotoxicidad Colonias (n) | ]]> Sectores segregantes | b FSC |
|
Control (frecuencia espontánea) | 8 | 42,0 | - | 27 | 44 | ]]> 1,62 |
| Control (frecuencia espontánea) |
8 | 39,1 | - | 27 | 32 | 1,18 |
| Etanol 1 % | 8 | ]]> 39,1 | - | |||
| Extracto hexánico de P.guajava L. (mg/mL de (medio de cultivo) | ]]> | |||||
| • 0,053 | 8 | 39,8 | -1,0 | 29 | 52 | 1,79 |
| • 0,265 | 8 | 33,0 | +15,0 | ]]> 29 | 54 | 1,86 |
| • 0,530 | 8 | 30,8 | +21,0 | 31 | 66 | 2,12 |
| ]]> Control positivoMMS (2,4 mM)c | 8 | 24,7 | +36,0 | 28 | 144 | 5,14 |
a Índice de toxicidad.
b Frecuencia de segregantes por colonia. ]]>
Tabla 3. Resultados del ensayo de Micronúcleos en médula ósea de ratón de cápsulas de Psidium Guajava L.
|
Tratamiento | Animales | IT ± SDa | PCE analizadosb | M PCEc | % m PCE ± SD |
| ]]>
Control negativo | 10 | 2,6 ± 0,35 | 20030 | 14 | 0,07 ± 0,06 |
| Carboximetilcelulosa | ]]> | ||||
| Control espontáneo | 10 | 2,5 ± 0,97 | 20041 | 16 | 0,06 ± 0,08 |
| Agua destilada | ]]> | ||||
| Dosis | |||||
| Psidium guajava L. mg/kg/pc/día | ]]> | ||||
|
2 000 | 10 | 2,7 ± 0,53 | 20025 | 18 | 0,10 ± 0,02 |
| ]]>
1 000 | 10 | 2,8 ± 0,48 | 20042 | 15 | 0,11 ± 0,05 |
|
500 | 10 | ]]> 2,4 ± 0,34 | 20046 | 19 | 0,13 ± 0,08 |
|
Control positivo | ]]> | ||||
|
Ciclofosfamida | 10 | 3,1 ± 1,06 | 20066 | 1240 | 6,12 ± 0,65** |
aÍndice de citoxicidad.
bEritrocitos policromáticos analizados. ]]>
Los resultados obtenidos permiten valorar respuestas de comportamiento semejante en los 2 métodos evaluados para la planta estudiada, teniendo en cuenta que la introducción de métodos toxicológicos alternativos favorece las investigaciones haciéndolas más económicas. Se debe destacar que los daños celulares encontrados en los diferentes órganos son reversibles y se consideran dentro de los límites histológicos normales.
Se consideró que el efecto citotóxico encontrado en el ensayo de genotoxicidad en Aspergillus nidulans pudo deberse a que en la medicina tradicional se reportó una acción antimicótica sobre dermatofitos, la cual ha sido comprobada experimentalmente9 y aunque el Aspergillus nidulans no es un dermatofito, por ser un hongo pudiera el extracto de la planta tener efecto antimicótico por este micro-organismo. No obstante resulta imposible descartar que el hexano extrajera de la droga (hojas secas molidas) alguna sustancia que provocara este efecto y que no sea extraíble por el agua que es polar.
En las condiciones de ensayo descritas (las hojas secas) de Psidium guajava L. no presentaron acción genotóxica ya que no se observó un incremento significativo en la frecuencia de micronúcleos en los eritrocitos policromáticos dosis dependiente. La existencia de un reporte de efecto antimutagénico en el sistema de ensayo con Salmonella tiphymurium10 permitió avalar los resultados obtenidos en este ensayo in vivo. Además se pudo apreciar, que la respuesta negativa in vitro obtenida para Aspergillus nidulans se confirmó en el ensayo in vivo.
Al Ing. Rafael Gárate García de los Laboratorios CIT, S.A., de CV, Edo. De México por suministrar el Psidium guajava L. droga, al Lic. Angel Vizozo, al Lic. Alberto Ramos, a la Dra. Mercedes Décalo y a Yoandra Rubalcaba por su ayuda en el trabajo experimental.
Recibido: 15 de noviembre del 2000. Aprobado: 2 de enero del 2001.
Lic. María Julia Martínez. Facultad de Ciencias Médicas "Dr. Salvador Allende". Laboratorio Central de Farmacología. Carvajal s/n e/n A y Agua Dulce. Cerro. Ciudad de La Habana. CP 12000. Cuba.
1 Investigadora Agregada.
2 Aspirante a Investigador.
3 Doctor en Ciencias Fisiológicas. Profesor Asistente. Especialista de II Grado en Farmacología. ]]>
4 Profesor Asistente.
5 Profesora Auxiliar. Especialista de II Grado en Anatomía Patológica ]]>