MsC. Aurora T. Pérez,1 MsC. Carol Carvajal,2 Lic. María J. Torres,3 Lic. María I. Martín,4 Téc. Danilo Pina,5 Dr. Reinaldo Trujillo,6 Dr. José Carlos Lorenzo,7 Dra. Claudia L. Natalucci2 y Dra. Martha Hernández8
Las enzimas proteolíticas aisladas de plantas de la familia Bromeliaceae se utilizan ampliamente en la industria médica, biotecnológica y alimenticia. Los estudios realizados en los últimos años sobre la actividad contra metástasis y tumores de las cisteíno-proteasas hacen que se incremente el interés por explorar nuevas fuentes naturales de obtención de fitoproteasas. En el presente trabajo se evaluó la actividad proteolítica de extractos enzimáticos obtenidos a partir de diferentes órganos de plantas de la familia Bromeliaceae. Se colectaron y clasificaron cinco grupos. Las plantas que se colectaron pertenecen a 3 géneros de la mencionada familia: 3 grupos son del género Tillandsia, 1 es del género Guzmania y otro del género Hohenbergia. Los mayores índices de actividad específica (3,3 U/mg de proteínas) se obtuvieron en los preparados obtenidos a partir de diferentes órganos de Hohenbergia penduliflora Mez, de cuyos extractos obtenidos se evaluó la influencia del pH de extracción y la actividad específica fue superior al realizarla a pH 3 a partir de sus tallos.
Palabras clave: Proteasas; Hohenbergia penduliflora Mez; actividad antitumoral.
Estas biomoléculas se han utilizado tradicionalmente como ablandadoras de carnes.5 Además, se utilizan como complemento alimenticio.6 Se ha descrito que muestran varias acciones farmacológicas: aumentan la absorción de otros medicamentos,7 se han utilizado en tratamientos de desórdenes digestivos,8 en enfermedades virales9 y en la formulación de vacunas. Tienen potencialidades como antiedematosas, antiinflamatorias, antitrombóticas y fibrinolíticas.10 Recientemente, se demostró la posible actividad antitumoral de cisteíno-proteasas como la bromelina.11 En investigaciones previas realizadas por nuestro grupo se demostró la actividad antitumoral de cisteíno-proteasas de piña y sus potencialidades de uso para la obtención de alimentos alternativos como hidrolizados de microalgas.12 Sin embargo, el número de proteasas vegetales que se han aislado y caracterizado es aún muy bajo y existen muchas fuentes naturales por explorar. Se han estudiado menos del 1 % de las especies vegetales conocidas,13 de ahí el marcado interés en la búsqueda de nuevas fuentes naturales de obtención de proteasas vegetales. Esta investigación se realizó con el objetivo de evaluar la actividad proteolítica de extractos enzimáticos obtenidos de diferentes órganos de plantas de la familia Bromeliaceae.
Se colectaron cinco grupos de plantas de la familia Bromeliaceae en zonas aledañas al poblado Modesto Reyes, Ciego de Ávila, Cuba. De cada grupo, se seleccionó un ejemplar adulto con flores y frutos en los casos posibles para su herborización. La clasificación del material vegetal se realizó en el herbario “Julián Acuña” del Centro de Estudios de Medio Ambiente y Educación Ambiental (CEMAEA) de Camagüey, Cuba, siguiendo las claves dicotómicas establecidas para esta familia14 y con los números de vouchers:
| Especie | ]]> Número herbario |
| Tillandsia pruinosa Sw. | 10456 |
| Tillandsia fasciculata Sw. | 10457 |
| Tillandsia sp. | 10458 |
| Guzmania sp. | 10459 |
| Hohenbergia penduliflora (L.) Rich. Mez. | ]]> 10460 |
Actividad enzimática: Se determinó por el método de Anson16 y se expresó en U/mL o U/kg de masa fresca. Se empleó como sustrato hemoglobina desnaturalizada al 2%, pH 6,8. Una unidad (U) es la cantidad de enzima que cataliza la formación de 1 µ mol de tirosina por minutos a 37°C y pH 6,8. La actividad específica se calculó como el cociente de la actividad enzimática entre la concentración de proteínas.
Las extracciones se realizaron como establece el procedimiento patentado por Hernández y otros.4 El material vegetal colectado se lavó y cortó en pequeños fragmentos. La molida se realizó en una batidora comercial WARING (2 L). Se utilizó la solución de extracción a pH 3. La proporción utilizada fue 1:1.5 para los tallos, 1:4 para hojas y 1:1.5 para frutos (m/v). Al preparado enzimático se le determinó la concentración de proteínas y la actividad enzimática.
Se repitió el procedimiento de extracción a pH 3, pH 4 y pH 5, a fin de evaluar la influencia de este indicador en la conservación de la actividad funcional de la enzima. Se procesaron 3 lotes de cada órgano. Se determinó la concentración de proteínas y la actividad enzimática para cada extracto.
El tratamiento estadístico se realizó con el empleo del utilitario Statistical Package for Social Sciences (SPSS, versión 8,0 para Windows). Se realizaron pruebas paramétricas (ANOVA, Tuckey p < 0,05) y no paramétricas (Kruskal-Wallis y Student-Newman-Keuls, p < 0,05). El mejor resultado de cada experimento se tomó de premisa para el siguiente.
De los 4 grupos del género Tillandsia se pudieron determinar 3 especies: Tillandsia pruinosa y Tillandsia fasciculata y el cuarto grupo sólo se pudo clasificar hasta el nivel taxonómico de género. La ausencia de flores, en el momento de la recolección, en las plantas del género Guzmania impidió conocer la especie en cuestión. El otro grupo de plantas pertenece a la especie H. penduliflora Mez.
En la Tabla 1 aparecen los resultados de la caracterización de las preparaciones enzimáticas crudas obtenidas de diferentes especies de plantas de la familia Bromeliaceae. Los mayores valores de actividad proteolítica se registraron para los extractos obtenidos a partir de tallos de H. penduliflora Mez (780,17 U/kg de masa fresca) con diferencia significativa respecto al resto de los preparados enzimáticos, seguido por los niveles alcanzados en los extractos de hojas de esa misma planta (75,50 U/kg de masa fresca). Los preparados enzimáticos procedentes de otras especies mostraron muy baja actividad proteolítica y en algunos casos no se detectó actividad.
Tabla 1. Caracterización de extractos enzimáticos crudos obtenidos a partir de 50 g tejidos de plantas de la familia Bromeliaceae.
| ]]> Especies | Órganos | Act. Proteolítica (U/kg de mf) | C. Proteínas | Act. Específica |
| Hohenbergia penduliflora | Hojas | 75,50 b | ]]> 100,50 d | 0,750 b |
| Tallos | 780,17 a | 550,45 a | 1,410 a | |
| Tillandsia pruinosa | Planta | 0 d | 327,60 b | ]]> 0 d |
| Tillandsia sp. | Hojas | 44,80 c | 192,00 c | 0,233 c |
| Tallos | 0 d | 53,10 d | 0 d | |
| ]]> Guzmania sp. | Hojas | 0 d | 105,00 c | 0 d |
| Tallos | 41,16 c | 135,24 c | 0,304 c | |
| Tillandsia fasciculata | ]]> Hojas | 0 d | 133,35 c | 0 d |
| Tallos | 0 d | 401,01 b | 0 d |
Medias con letras iguales para cada indicador no difieren (Kruskal-Wallis, Student-Newman-Keuls, p < 0,05).
La concentración de proteínas mostró los mayores valores para los extractos de tallos de H. penduliflora Mez. (550,45 mg de proteínas/kg de masa fresca), los que difirieron significativamente del resto de los extractos evaluados. En los preparados de tallos de T. fasciculata y T. pruinosa se obtuvieron cuantificaciones de proteínas entre 300.00 y 400.00 mg/kg de masa fresca, pero como se analizó anteriormente en esas preparaciones no se detectó actividad proteolítica.
]]> Los mayores índices de actividad específica (1.410 U/mg de proteínas) se observaron para los preparados obtenidos de tallos de Hohenbergia penduliflora Mez con diferencias significativas del resto de las preparaciones crudas analizadas. Este indicador refleja la pureza del extracto, lo que significa que esta especie posee en mayor proporción las enzimas de interés en el material vegetal. Es por esto que se decidió, en lo adelante, centrar el estudio en las proteasas presentes en diferentes órganos de esta planta.En la fig. se muestra la actividad proteolítica (U/kg de masa fresca); concentración de proteínas (mg/kg de masa fresca) y actividad específica (U/mg de proteínas) de extractos obtenidos a partir de diferentes órganos de H. penduliflora Mez, al realizar el procedimiento de extracción a pH 3, 4 y 5.
Como se puede apreciar la actividad proteolítica (Fig. A) tuvo su mejor resultado cuando la extracción se realizó a pH 3 a partir de los tallos (715,392 U/kg de masa fresca), con diferencias significativas del resto de los tratamientos. Para este órgano el incremento del pH de extracción provocó una disminución de la actividad proteolítica. Para el caso de las hojas, este indicador no tuvo diferencias significativas entre los pH evaluados. Por su parte, los frutos mostraron un incremento en la actividad proteolítica con el aumento del pH, sin diferencias significativas entre los valores obtenidos para pH 4 y 5 (73,440 y 90,720 U/kg de masa fresca respectivamente).
Para la concentración de proteínas (fig. B) el mejor resultado (597,27 mg/kg de masa fresca) se logró en preparados de tallos de H. penduliflora Mez. Al realizar la extracción a pH 5, seguido por las cuantificaciones a pH 3 y 4 para este mismo órgano, sin diferencias significativas entre ellos (540,038 y 495,977 mg/kg de masa fresca respectivamente). Los valores obtenidos para los frutos no difirieron entre sí para los diferentes pH y fueron superiores a los obtenidos en las hojas. Las hojas son el órgano donde se observaron las menores concentraciones de proteínas totales sin diferencias significativas entre los pH evaluados.
Al analizar la actividad específica (Fig. C) se pudo apreciar que el mejor resultado le correspondió a los tallos cuando la extracción se hizo a pH 3 (1,33 U/mg de proteínas), con diferencias significativas respecto al resto de los tratamientos. Para los tallos este indicador disminuyó con el incremento del pH. En los preparados enzimáticos obtenidos a partir de hojas, el pH de extracción no influyó en los niveles alcanzados para este importante indicador. Por su parte, para los frutos se evidenció un incremento en la actividad específica con el aumento del pH de extracción, sin diferencias significativas entre los valores obtenidos para pH 4 y 5 (0,369 y 0,434 U/mg de proteínas, respectivamente).
En la Tabla 2 se exponen los principales indicadores que permiten interpretar los rendimientos para los extractos de cada órgano al mejor pH de la extracción. Los resultados demuestran que los rendimientos en términos de proteínas son mayores para los extractos de tallos (540,39 mg de proteínas/kg de masa fresca), seguidos por los de frutos (90,72 mg de proteínas/kg de masa fresca) y hojas (89,39 mg de proteínas/kg de masas fresca) con diferencias significativas entre ellos. Similar comportamiento se observó en el caso de la actividad enzimática y por ende la actividad específica.
Tabla 2. Rendimientos de la extracción de proteasas a partir de diferentes órganos de Hohenbergia penduliflora Mez al mejor pH de extracción evaluado. Se procesaron nueve lotes de cada órgano.
]]>| | Tallos | Hojas | Frutos |
| pH 3 | pH 4 | pH 5 | |
| Masa fresca (kg) | 0,050 a | ]]> 0,050 a | 0,030 a |
| Actividad enzimática (U/mL) | 0,477 a | 0,025 c | 0,060 b |
| Actividad enzimática ( U/kg de masa fresca ) | 715,39 a | 72,67 c | 90,72 b |
| ]]> Concentración de proteínas (mg/mL) | 0,360 a | 0,030 c | 0,140 b |
| Rendimiento (mg de prot./kg de masa fresca) | 540,39 a | 89,39 c | 210,57 b |
| Actividad específica (U /mg de proteínas) | 1,33 0 a | ]]> 0,02 0 c | 0,434 b |
*Medias con letras iguales para cada indicador no difieren (Kruskal-Wallis, Student-Newman-Keuls, p < 0,05).
De las proteasas aisladas a partir de plantas de la familia Bromeliaceae las más estudiadas y mejor caracterizadas son las obtenidas de A. comosus L. (Merr).17 Hernández y otros18 compararon los niveles de proteínas, actividad enzimática y actividad específica de extractos provenientes de diferentes órganos de la planta de piña, al utilizar la misma metodología de extracción de este estudio y obtuvieron cantidades similares de proteínas (3.7-3.9 g de proteínas/kg de masa fresca), independientemente del órgano utilizado. L os mayores valores de actividad proteolítica (U/kg de masa fresca) se registraron para los preparados de tallos de piña (5357.9 U/Kg de masa fresca). Estos resultados son similares a los obtenidos en esta investigación donde los mejores, en cuanto a actividad enzimática y específica, se obtuvieron para los tallos de H. penduliflora Mez.
En los últimos años existen muchas investigaciones encaminadas a explicar los mecanismos de activación de las cisteíno proteasas in vivo. Se ha demostrado claramente que la activación de estas enzimas depende del pH.19 Los autores sugieren un predominio de moléculas de enzima activa a pH ácido y está claro que las variaciones de pH neutro a pH ácido en las vacuolas provocan cambios en la conformación nativa de la enzima inactiva, lo que permite el procesamiento y plegamiento de la enzima activa.20
Hernández y otros18 estudiaron la influencia del pH (2, 3 y 4) en la extracción de enzimas proteolíticas a partir de tallos de A. comosus L. (Merr). Los mayores valores de concentración de proteínas, actividad enzimática y actividad específica los obtuvieron cuando la extracción se realizó a pH 3, resultados similares a los mostrados en esta investigación, en la que se demostró que los rendimientos dependen del pH y se ven favorecidos cuando el procedimiento de extracción se realiza a partir de tallos de H. penduliflora Mez. a pH 3. Esto sugiere que las proteasas presentes en este órgano se activan a valores de pH ácidos. En el caso de los extractos de frutos se observó una tendencia a lograr mejores resultados en la medida que se incrementó el pH. Es posible que la proporción de enzimas presentes en ese órgano tengan características ácido-base diferentes a las del tallo; de ahí que para los frutos, realizar las extracciones a pH más cercano al neutro podrían mostrar resultados interesantes. El procedimiento de extracción usado para obtener proteasas a partir de diferentes órganos de H. penduliflora Mez. es sencillo y económico, además los preparados tienen alta actividad proteolítica.
El método utilizado en estos estudios no sólo es simple y económico, sino también eficaz en cuanto a rendimientos y calidad (actividad) de los preparados enzimáticos. Esto puede estar relacionado con una disminución de la autoproteólisis a valores de pH ácidos, así como la protección-activación de los grupos –SH- del centro activo durante la extracción. Estos factores contribuyen a que aún sin utilizar procedimientos de purificación como la precipitación, que incrementa los valores de actividad específica de los preparados enzimáticos, se obtengan valores de actividad específica aceptables para preparados crudos de plantas de esta familia. Las proteasas presentes en los extractos enzimáticos de H. penduliflora Mez. pudieran tener usos similares a las obtenidas a partir de A. comosus L. (Merr).
Las investigaciones fueron financiadas por el Ministerio de Ciencia Tecnología y Medio Ambiente de Cuba y por el Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnología para el Desarrollo (CYTED), Proyecto IV.22 “Aplicación industrial de Enzimas Proteolíticas de Vegetales Superiores”, coordinado por el Dr. Néstor Oscar Caffini. María José Torres y María Inés Martín son becarias del CONICET. Claudia L. Natalucci es Investigadora de la CIC PBA.
The proteolytic enzymes isolated from the Bromeliaceae family are widely used in the medical, biotechnological, and food industries. The studies conducted in recent years on the activity against metastasis and cysteine-proteases, increase the interest in screening new natural sources of obtention of phytoproteases. In the present paper, the authors assessed the proteolytic activity of enzymatic extracts obtained from different organs of the Bromeliaceae family plants. Five groups were collected and classified. Plants obtained belong to three genuses of the above mentioned family: 3 groups are of genus Tillandsia , one of genus Guzmania , and the other of genus Hohenbergia . The highest rates of specific activity (3.3 U/mg of proteins) were attained in preparations obtained from different organs of Hohenbergia penduliflora Mez. from whose extracts the influence of extraction pH was assessed. The specific activity was greater on carrying it out at pH3, starting from their stalks.
Key words: Proteases, Hohenbergia penduliflora Mez, antitumoral activity.
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Msc. Aurora T. Pérez. Laboratorio de Ingeniería Metabólica. Centro de Bioplantas. Universidad de Ciego de Ávila. Carretera a Morón Km. 9, Ciego de Ávila, Cuba. Teléfono: 053-33 224016, Fax: 053-33 266340.
e-mail: aperez@bioplantas.cu
1Máster en Biotecnología Vegetal. Aspirante a Investigador.
2Máster en Biotecnología Vegetal. Especialista en Análisis Químico.
3Licenciada en Bioquímica.
4Licenciada en Bilogía.
5Técnico A de Investigación.
6Doctor en Ciencias Agrícolas. Investigador Auxiliar. ]]>
7Doctora en Ciencias Biológicas. Investigadora de la CIC PBA, Argentina.
8Doctora en Ciencias Bilógicas. Investigadora Auxiliar