Espermidina e espermina exogena na micropropagação de Aloe vera (L.) Burm

Dra.Gilda Mógor,1 Dra. Giuseppina Pace Pereira Lima2 y Dr. Atila Mogor1

Resumo

Ápices caulinares de Aloe vera L. Burm. foram inoculados em meios de cultura. O experimento foi dividido em duas fases. Na fase I diferentes concentrações e combinações de NAA e BAP foram adicionadas ao meio MS . Na fase II, p lantas provenientes de MS foram inoculadas em meio contendo ou não espermidina e/ou espermina. Na fase I, os melhores resultados para produção de massa e perfilhamento ocorreram em MS + 8,88 m mol.L -1 BAP + 5,36 m mol.L -1 NAA e não foi observado enraizamento. Plantas submetidas aos tratamentos com poliaminas (10 mM) apresentaram emissão de raízes na fase II, sugerindo possível efeito indutor, quando usadas isoladamente durante a rizogênese. Não foram notados indícios de oxidação no meio de cultura contendo poliaminas. O uso de espermidina no meio de cultura promoveu maior incremento de massa e o maior número de perfilhos foi obtido com o uso da combinação das poliaminas.

Palavras clave: poliaminas, reguladores vegetais, micropropagação, enraizamento.

Resumen

Ápices caulinares de plantas de Aloe vera L. Burm. fueron inoculados en medios de cultivo. El experimento fue dividido en dos fases. En la fase l diferentes concentraciones y combinaciones de NAA y BAP fueron adicionadas al medio MS. En la fase II, plantas provenientes del tratamiento MS fueron inoculadas en medio que contenía, o no, espermidina y/ o espermina. En la fase I, los mejores resultados para producción de masa y brotaciones ocurrieron con el uso de MS + 8,88 m mol L -1 BAP + 5,36 m mol L -1 NAA y no indujeron al enraizamiento. Las plantas sometidas a los tratamientos con espermidina o espermina (10 mM) presentaron emisión de raíces durante la fase II, sugiriendo un posible efecto inductor, cuando fueron usadas aisladamente durante la rizogénesis. No fueron notados indicios de oxidación en el medio de cultivo que contenía poliaminas. El uso de espermidina en el medio de cultivo promovió mayor incremento de masa y un mayor número de brotaciones fue obtenido con el uso de la combinación de las poliaminas.

Palabras clave: Poliaminas, reguladores vegetales, micro propagación, enraizamiento.

O uso de plantas medicinais representa um recurso terapêutico amplamente difundido, sendo utilizado desde a antiguidade. Entre as inúmeras plantas estudadas com potencial fitoterápico inclui-se o gênero Aloe, sendo a espécie Aloe vera (L.) Burm. (Liliaceae) a mais utilizada no emprego medicinal, tendo como sinonímia A. barbadensis Mill., conhecida como babosa de folhas grandes.1

Nos últimos anos, a demanda por parte das indústrias tem aumentado consideravelmente, porém a oferta de biomassa de Aloe vera não tem sido suficiente.2 O crescimento lento e o baixo rendimento em relação à multiplicação convencional são os principais fatores que contribuem para essa demanda freqüente.3

Diversos estudos relatam o cultivo in vitro de Aloe , assim como o estabelecimento de protocolos, indução de calos e regeneração,4cultivo de ápices e perfilhamento, estabelecimento de protocolo de micropropagação com alta taxa de multiplicação.3,5 Nestes trabalhos os autores citam a eficiência dos reguladores utilizados, tais como auxinas e citocininas, em diferentes concentrações e combinações, objetivando a obtenção de plantas sadias e em grande número, porem pouco se sabe sobre a ação das poliaminas na micropropagacao de babosa.

Como a necessidade do mercado vem aumentando a demanda da produção de mudas, o objetivo deste trabalho foi de estudar a interação das poliaminas espermidina e espermina com auxina e citocinina, durante a micropropagação de Aloe vera (L.) Burm.

MÉtodos

Plantas de Aloe vera (L.) Burm. cultivadas em condições de campo, no Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas (CPQBA), da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), foram utilizados como doadoras de explantes. Ápices caulinares oriundos de brotações laterais, com tamanho variando entre 0,5 e 1,0 cm de altura, foram retirados com auxílio de bisturi, lavados em água corrente e transferidos para erlenmeyer contendo água destilada. A desinfestação dos explantes foi realizada em câmara de fluxo laminar, utilizando solução de hipoclorito de sódio 30% (água sanitária comercial, contendo 2 % de cloro ativo), onde permaneceram por 20 minutos, sendo em seguida submetidos a sucessivas lavagens em água destilada autoclavada e imersos em solução de álcool 70% durante 60 segundos, seguido de novas lavagens em água destilada autoclavada. O meio de cultura utilizado MS 19628 acrescido de 30 g.L -1 de sacarose, 100 mg.L -1 de inositol, 1,0 mg.L -1 de tiamina e 6 g.L -1 de ágar, sendo o pH ajustado para 5,8 (com NaOH ou HCl) de acordo com os tratamentos (Tabela 1). O meio de cultura foi submetido à autoclavagem a 120 o C e 1 atm de pressão durante 15 minutos. Os explantes foram inoculados (um explante por tubo) e transferidos para sala de crescimento com temperatura de 25 ± 2°C, 85 % U.R., fotoperíodo de 16 horas e intensidade luminosa de 1000 lux.

O experimento foi dividido em duas fases. Na fase I, diferentes concentrações de ácido naftalenoacético (NAA) e 6-benzilaminopurina (BAP) foram adicionadas ao meio de cultura (Tabela 1), totalizando quatro tratamentos com 10 repetições, sendo cada repetição composta de quatro explantes, distribuídos em delineamento experimental em blocos casualizados. As médias foram comparadas pelo teste de Tukey a 5% de significância. A Tabela 1 apresenta a composição do meio de cultura utilizado nos tratamentos durante a fase I.

Plantas provenientes do tratamento MS (sem adição de reguladores vegetais) da fase I, foram utilizadas na instalação do experimento da fase II, visando dessa forma à utilização de plantas desenvolvidas em meio isento de reguladores vegetais. Na fase II foram adicionadas as poliaminas espermidina (Spd) e espermina (Spm) ao meio de cultura (Tabela 1), e após definido o melhor tratamento da fase I (caracterização), adotou-se o mesmo balanço de reguladores da fase I (melhor resultado) na instalação de um dos tratamentos da fase II, totalizando quatro tratamentos com 5 repetições, cada repetição composta de 4 explantes, distribuídos em delineamento experimental, em blocos casualizados. As médias foram comparadas pelo teste de Tukey a 5% de significância. A Tabela 1 apresenta a composição do meio de cultura utilizado nos tratamentos durante a fase II.

Plantas provenientes do tratamento MS (sem adição de reguladores vegetais) da fase I, foram utilizadas na instalação do experimento da fase II, visando dessa forma à utilização de plantas desenvolvidas em meio isento de reguladores vegetais. Na fase II foram adicionadas as poliaminas espermidina (Spd) e espermina (Spm) ao meio de cultura (Tabela 1), e após definido o melhor tratamento da fase I (caracterização), adotou-se o mesmo balanço de reguladores da fase I (melhor resultado) na instalação de um dos tratamentos da fase II, totalizando quatro tratamentos com 5 repetições, cada repetição composta de 4 explantes, distribuídos em delineamento experimental, em blocos casualizados. As médias foram comparadas pelo teste de Tukey a 5% de significância. A Tabela 1 apresenta a composição do meio de cultura utilizado nos tratamentos durante a fase II.

A solução de poliaminas foi adicionada ao meio de cultura MS (Tabela 1) previamente autoclavado e resfriado (aproximadamente 45 °C), com o auxílio de seringa descartável e filtros acopláveis MILLEX ® Millipore, contendo poros de 0,22 µm, sendo este procedimento realizado em câmara de fluxo laminar. Posteriormente, o meio de cultura foi distribuído em frascos de vidro (268 mL de capacidade) previamente esterilizados, com 40 mL de meio em cada frasco. Após o resfriamento do meio de cultura foi realizada a inoculação, sendo colocada uma planta por frasco. Em seguida, foram transferidos para sala de crescimento com temperatura de 25 ± 2°C, 85% U.R., fotoperíodo de 16 horas e intensidade luminosa de 1000 lux, onde permaneceram por 30 dias, totalizando 120 dias do início do experimento.

Características avaliadas - Durante a fase I foram realizados três subcultivos, em intervalos de 30 dias cada, totalizando 90 dias. Avaliou-se o número de perfilhos (brotações laterais de plantas in vitro ), contaminação fúngica e bacteriana, oxidação, enraizamento e porcentagem de plantas desenvolvidas.

Foram avaliados na fase II o número de perfilhos, presença de raízes e também a massa fresca e massa seca da planta-mãe (explante inicial), perfilhos e rizomas produzidos.

Resultado

Aos 30 dias de cultivo in vitro de A. vera, observou-se taxa média de sobrevivência de 91,87%, com a ocorrência de pequeno número de explantes contaminados por fungos (1,87%), bactérias (3,12%) ou oxidados (3,12%), o que evidencia a eficiência do método de assepsia utilizado.

Aos 90 dias, os perfilhos referentes ao tratamento sem adição de reguladores vegetais (Tratamento MS), foram destacados do explante inicial e utilizados na instalação do experimento da fase II. Na Tabela 2 verifica-se a média do número de perfilhos, nos três subcultivos.

TABELA 1. Composição do meio de cultura nos tratamentos durante a fase de obtenção de brotações (fase I e fase II).

TABELA 2. Fase I – Número médio de perfilhos nos tratamentos, aos 30, 60 e 90 dias da instalação do experimento.

Na primeira avaliação (aos 30 dias), o tratamento MS + 8,88 m mol.L -1 de BAP + 5,36 m mol.L -1 de NAA apresentou maior perfilhamento, com média de 3,35 perfilhos por explante inicial. Os demais tratamentos não apresentaram diferença estatística aos 30 dias. O tratamento 1, considerado controle, como demonstrado em todos os subcultivos, apresentou o menor perfilhamento, o que ressalta a importância dos reguladores vegetais na micropropagação de Aloe vera.

Resultados semelhantes foram observados aos 60 e 90 dias, isto é, maior número de perfilhos foi obtido quando se utilizou a combinação de 8,88 m mol.L -1 de BAP com 5,36 m mol.L -1 de NAA. Esses resultados evidenciam maior perfilhamento à medida que a concentração de BAP e NAA aumentam. Os tratamentos utilizados não induziram o enraizamento no período avaliado em A. vera.

Na instalação do experimento na fase II foram utilizadas apenas as plantas oriundas do tratamento MS (controle), objetivando evitar o possível efeito residual dos reguladores vegetais utilizados na fase I. O tratamento 1 da fase II consistiu na repetição do mesmo balanço hormonal considerado como sendo o melhor tratamento da fase I (caracterização). Aos demais tratamentos foram adicionadas poliaminas exógenas (espermidina e espermina), com o objetivo de avaliar possíveis alterações proporcionadas pela adição dessas substâncias.

Na TABELA 3 encontram-se os resultados obtidos para massa fresca (expressa em gramas) e número de perfilhos, nos diferentes tratamentos aplicados em A. vera.

TABELA 3. Massa fresca (planta-mãe, perfilhos e rizomas) e média dos perfilhos das plantas de Aloe vera (L.) Burm., aos 30 dias na fase II, 120 dias do início do experimento.          

Os tratamentos na fase II do experimento (Tabela 3) não influenciaram significativamente a produção de massa fresca da planta-mãe; por outro lado, as poliaminas exógenas afetaram a produção de massa fresca dos perfilhos, sendo as maiores médias encontradas no tratamento contendo espermidina. A maior média da massa fresca dos rizomas foi encontrada no tratamento contendo a combinação das duas poliaminas, porém não diferiu significativamente do tratamento contendo somente espermidina, evidenciando que a presença dessa poliamina no meio tende a incrementar a massa fresca de Aloe in vitro. Quanto ao número de perfilhos, o tratamento contendo a combinação de espermidina e espermina diferiu estatisticamente dos demais.

Tratamento sem poliaminas resultou em dados semelhantes àqueles encontrados aos 30 dias da instalação do experimento (fase I).

Na Tabela 4 verifica-se o efeito dos tratamentos sobre a produção de massa seca (expressa em gramas) ao final da fase II. A média da massa seca da planta-mãe não diferiu estatisticamente nos tratamentos. Quanto a massa seca do rizoma e dos perfilhos, os tratamentos 3 (MS + Spd) e 4 (MS + Spm + Spd) não diferiram estatisticamente, mas apresentaram maior média.

TABELA 4. Massa seca da planta-mãe, perfilhos e rizomas das plantas de Aloe vera (L.) Burm., aos 30 dias na fase II, 120 dias do início do experimento.

As plantas submetidas aos tratamentos com espermidina ou espermina apresentaram emissão de raízes durante a fase II.

Discussão

Em relação à assepsia usada para babosa, pode-se afirmar que foi muito eficiente, pois nota-se que, mesmo utilizando tempo de imersão em solução de hipoclorito de sódio inferior ao utilizado por 3, a taxa de sobrevivência foi próxima a encontrada pelos autores, que utilizando ápices caulinares de A. vera em solução de hipoclorito de sódio 40% (20 minutos) e solução de álcool 70% (1 minuto), obtiveram taxa de sobrevivência de 93,33%.

O tempo de imersão aos quais os explantes foram submetidos buscou minimizar possíveis efeitos de oxidação, problema freqüentemente encontrado no isolamento de explantes. O tempo de exposição na solução de hipoclorito de sódio, agressivo aos tecidos vegetais, pode favorecer o escurecimento promovido pela oxidação de compostos fenólicos. Para Aloe polyphylla, o uso de álcool 70% por dois minutos, seguido de hipoclorito de sódio 1% por 10 minutos, foi eficiente para desinfestação das sementes inoculadas in vitro , resultando em plantas sadias sem sintomas de oxidação.9

No presente trabalho, não foram separados os perfilhos da planta mãe (explante inicial) devido ao problema da oxidação observado, tentando dessa maneira, evitar o escurecimento dos tecidos, já que aos 30 dias foi notado formação de novos rizomas com danos de oxidação. Plantas de Aloe são ricas em compostos fenólicos que afetam o crescimento de culturas in vitro e causam o escurecimento do explante e do meio circunvizinho e esse escurecimento parece ser o fator limitante para o estabelecimento de cultura de tecidos de espécies de Aloe. O uso de reguladores, tais como N-6-benziladenina (BA), cinetina (KIN), thidiazuron (TDZ), ácido 3-indolilacético (IAA), isolados ou em combinação com 2,4-D, foram relatados por aumentar o escurecimento em culturas de Aloe.9 O uso de antioxidantes no meio de cultura é comum na micropropagação, tais como polivinilpolipirrolidona (PVPP), 1,4 ditio-DL-treitol (DTT), entre outros. Em trabalhos com A. vera, 4 utilizaram polivinilpirrolidona (PVP) e notaram diminuição no escurecimento promovido por oxidação de fenóis. Neste trabalho, onde não foram utilizados antioxidantes, foi observado escurecimento em volta dos rizomas formados, assim como na base e nos rizomas dos explantes, contudo, este fato, aliado à freqüente troca de meio parece não ter alterado o crescimento, quando comparados com plantas que não mostraram oxidação, apesar da relação inversa entre alguns tipos de fenóis e crescimento ser descrito na literatura por alguns autores.10

Os resultados observados quanto ao número de perfilhos aos 60 e 90 dias, quando foi usada a combinação de 8,88 m mol.L -1 de BAP com 5,36 m mol.L -1 de NAA podem ser atribuídos à ação dos reguladores vegetais usados. O efeito benéfico do N-6-benziladenina (BA), uma citocinina com ação semelhante ao 6-benzilaminopurina (BAP), na multiplicação de brotos de plantas do gênero Aloe tem sido descrita na literatura por diversos autores 9. 3 utilizaram como fonte de explantes gemas apicais, oriundas de plântulas de Aloe vera cultivadas in vitro em meio de cultura MS acrescido de 4,44 m mol L -1 de BAP e obtiveram como resultado 3,5 brotos por explante inicial, aos 30 dias de cultivo, semelhante ao encontrado no presente trabalho.

Outros trabalhos demonstram também a ação benéfica do uso de citocininas em combinação com auxinas, como encontrado durante a micropropagação de 16 genótipos de procedências diferentes de A. vera por 2, onde a combinação BAP (6,67 m mol.L -1 ) e NAA (4,03 m mol.L -1 ) de induziu aumento do número de perfilhos, sendo que aos 35 dias, a média de 1:2 foi obtida, embora tenha ocorrido a formação de até 1:8 2 . 5 relataram taxa de multiplicação máxima de 1:15 em 4 semanas, utilizando meio de cultura MS semi-sólido com 2,0 mg.L -1 de BA e 0,3 mg.L -1 de NAA, na micropropagação de Aloe vera (L.) var. chinensis.

A rizogênese encontrada em A. vera não foi dependente do período de cultivo, que neste trabalho foi de 90 dias e pouco numeroso, como sugerido por alguns autores. Segundo 2, o processo de rizogênese em Aloe vera mostrou-se dependente do tempo de cultivo e sugerem que a indução à rizogênese in vitro parece estar associada ao esgotamento gradativo dos nutrientes no meio de cultura, indicando tempo médio de cultivo de 45 dias. Por outro lado, a baixa formação de raízes pode ser atribuída aos reguladores vegetais usados e às suas concentrações e combinações.9 relatam que plantas de Aloe polyphylla cultivadas em meio com baixa concentração de BA enraizaram algumas vezes espontaneamente, mas não atribuem este resultado ao efeito do regulador ou mesmo sua concentração.

Na fase II as poliaminas usadas exógenamente afetaram a produção de massa fresca dos perfilhos e o número de perfilhos encontrado pode ser resultado positivo da associação destas poliaminas. Neste caso, nota-se que o número de perfilhos foi alto também no tratamento contendo apenas espermidina como fonte de poliamina, indicando possivelmente que essa substância quando usada exogenamente tende a promover maior divisão e crescimento celular nesta planta.

Explantes cultivados em meio ausente de poliaminas na fase II mostraram os mesmos resultados encontrados aos 30 dias. Esse resultado demonstra que o tipo de explante utilizado não interferiu no número de perfilhos, pois enquanto a fase I utilizou ápices caulinares oriundos de plantas cultivadas in vivo (em condições de campo), na fase II utilizou-se plantas estabelecidas in vitro. Assim, nestas análises, a adição de espermidina ao meio de cultura mostrou-se eficiente na micropropagação de Aloe vera e representa uma alternativa mais econômica em relação ao uso em associação com a espermina.

Espermidina exógena, assim como putrescina e agmatina, têm sido descritas por estimularem desenvolvimento e crescimento de microplântulas de morango, sugerindo que essas substâncias podem atuar no crescimento.12

Espermidina teve um papel importante na indução de perfilhos e aumento de massa em Aloe vera no presente trabalho (Tabela 4), diferente do descrito13 por que analisaram os níveis de poliaminas endógenas e não encontraram correlação com formação de agregados meristemáticos em E. camaldulensis.

A partir desses resultados, nota-se que o efeito exógeno das poliaminas espermidina e espermina foi positivo no crescimento e perfilhamento. O efeito estimulante no crescimento e formação de brotos por poliaminas exógenas tem sido comprovado e recomendado por diversos autores.14

Foram notados nesta fase do trabalho, poucos indícios de oxidação em plantas ou no meio contendo poliaminas. Escurecimento acentuado foi observado apenas no controle, o que foi contornado com as trocas freqüentes de meio de cultura e parece não ter influenciado no desenvolvimento das plantas. O escurecimento de tecidos ou do meio de cultura pode gerar danos celulares. As poliaminas, principalmente putrescina e espermidina, foram descritas por diminuir ou amenizar os danos celulares causados por estresse oxidativo (escurecimento)15 e provavelmente, neste trabalho, o bom desenvolvimento encontrado pode ser atribuído à efetividade das poliaminas contra os possíveis danos oxidativos (proteção de membranas, redução de peroxidação de lipídeos, prevenção de formação de radicais livres), além de sua ação no crescimento como descrito por diversos autores.14

O enraizamento observado na fase II nos tratamentos usando espermidina ou espermina, podem sugerir um possível efeito indutor dessas substâncias quando aplicadas isoladamente, pois o tratamento contendo a combinação das duas substâncias não apresentou desenvolvimento de raízes, em contrapartida, a associação entre espermidina e espermina promoveu aumento no perfilhamento.16 relatam que putrescina endógena e IAA aumentaram tanto na indução de raízes como na fase de iniciação, enquanto que os teores de espermidina e espermina não apresentaram mudanças significativas nessas fases, em Vigna radiata (L.). De acordo com17 a aplicação de poliaminas exógenas não induz a formação de raízes, diferente do relato de outros autores que mostram a possível essencialidade dessas substâncias na rizogênese de diversas espécies vegetais.6

Descreveram a redução do enraizamento e acúmulo de putrescina e espermidina,18 o qual foi revertido quando usaram dimetiluréia (DMTU) e atribuem este fato à formação de peróxidos gerados pela ação de poliaminaoxidase, durante a oxidação de espermidina e afirmam que espermidina exógena seria prejudicial ao processo de formação de raízes. Neste trabalho, espermidina e espermina podem ter estimulado a rizogênese em Aloe vera, como também encontrado em trabalho de.15

O uso de espermidina ou espermina exógena durante a micropropagação de Aloe vera (L.) Burm. promoveu bom desenvolvimento das plantas e indução à rizogênese. A aplicação isolada de espermidina foi eficiente no perfilhamento. A associação das duas poliaminas não induziu a rizogênese e incrementou o perfilhamento.

Resumen

Es permidine y espermine exógeno en el micropropagación de Aloe vera (L.) Burm

Ápices caulinares de plantas de Aloe vera L. Burm. fueron inoculados en medios de cultivo. El experimento fue dividido en dos fases. En la fase l diferentes concentraciones y combinaciones de NAA y BAP fueron adicionadas al medio MS. En la fase II, plantas provenientes del tratamiento MS fueron inoculadas en medio que contenía, o no, espermidina y/ o espermina. En la fase I, los mejores resultados para producción de masa y brotaciones ocurrieron con el uso de MS + 8,88 mmol L-1 BAP + 5,36 mmol L-1 NAA y no indujeron al enraizamiento. Las plantas sometidas a los tratamientos con espermidina o espermina (10 mM) presentaron emisión de raíces durante la fase II, sugiriendo un posible efecto inductor, cuando fueron usadas aisladamente durante la rizogénesis. No fueron notados indicios de oxidación en el medio de cultivo que contenía poliaminas. El uso de espermidina en el medio de cultivo promovió mayor incremento de masa y un mayor número de brotaciones fue obtenido con el uso de la combinación de las poliaminas.
Palabras  clave: Poliaminas, reguladores vegetales, micro propagación, enraizamiento.

Summary

Exogenous spermidine and spermine in micropropagation of Aloe vera (L.) Burm

Key words: polyamines, plant growth regulators, micropropagation, rooting.

ReferÉncia BibliogrÁficaS

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Recibido: 1 ro de marzo de 2007. Aprobado: 26 de abril de 2007.
Dra.Gilda Mógor. Profa. Livre Docente Giuseppina Pace Pereira Lima, Laboratório de Micropropagação e Análises Químicas, Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista, UNESP, Botucatu, São Paulo, Brasil.
E-mail: gpplima@ibb.unesp.br

1Doutor.
2Doutor. Professora Livre-Docente.