ARTÍCULO ORIGINAL
Efecto de Uncaria tomentosa en la mutagénesis de Salmonella typhimurium inducida por 7,12 dimetilbenzantranceno con activación metabólica in vitro
Effect of Uncaria tomentosa in the mutagenesis of Salmonella typhimurium induced by 7,12 dimethylbenzanthrancene with metabolic activation in vitro
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Jorge Luis Chin WongI; Percy Ordemar VásquezI; Aníbal Monge MoyanoII; Mario Moreno MantillaIII
I Médico Cirujano. Egresado de la Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo (UNPRG). México.
II Médico Cirujano. Docente de la Cátedra de Patología Clínica UNPRG. México.
III Licenciado en Biología. Docente de la Facultad de Ciencias Biológicas. México.
Palabras clave: Uncaria tomentosa, antimutagénesis, prueba de Ames, activación metabólica, 7,12 dimetilbenzantraceno.
Objective: to verify the anitmutagenic properties of Uncaria tomentosa (Willd. ex Roem. & Schult.) DC. in a model of modified Ames' test.
Methods: a prospective experimental study was conducted by using an auxotrophic strain of Salmonella typhimurium TA-102 his(-) in 2 groups, one control and one experimental; the latter was divided into 4 subgroups treated with increasing doses of U. tomentosa. Mutagenesis was induced in both groups with 7,12 dimethylbenzanthracene in a system of metabolic activation with freeze-dried of liver microsomes. To establish the statistical significance, the Student's t test was used.
Results: it was observed a reversal of colonies inversely proportional to the dose of freeze-dried of U. tomentosa; the average count was 333 ± 14 colonies/plaque for the dose of 750 mg, whereas for the control group it was 606 ± 21 colonies/plaque with a statistically significant difference (p< 0,05). ]]>
Conclusions: U. tomentosa has antimutagenic properties in this experimental model.
Key words: Uncaria tomentosa, antimutagenesis, Ames' test, metabolic activation, 7,12 dimethylbenzanthracene.
INTRODUCCIÓN
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Uncaria tomentosa (Willd. ex Roem. & Schult.) DC. es una planta perteneciente a la familia Rubiaceae, comúnmente conocida como "uña de gato", es una liana trepadora de los bosques húmedos. La distribución es amplia en Perú, se encuentra en los departamentos de Loreto, Pasco, Junín, San Martín, Cusco, Madre de Dios; también en Colombia, Brasil, Guyana, Trinidad y Tobago, Bolivia y América Central. Los indígenas de la amazonía peruana como los Ashaninkas, Boras, Aguarunas, Huambisas, Shipibos, Conibos, Piros, Jíbaros, entre otros, han empleado desde hace siglos a U. tomentosa como vigorizante para aumentar el rendimiento en el trabajo; también es y ha sido empleada en la medicina tradicional de Perú para el tratamiento de la artritis reumatoide, gastritis, procesos virales, gonorrea, cirrosis, procesos neoplásicos genitales femeninos, entre otras enfermedades, cuando es utilizada como extracto acuoso de la corteza.1-3La creciente investigación sobre los principios activos contenidos en esta planta revela un gran número de componentes en las hojas, el tallo, la corteza y las raíces, los cuales han sido objeto de múltiples estudios que demuestran actividad biológica. A estos principios activos se le atribuyen propiedades citostáticas, anticonceptivas y antiinflamatorias.4-6 También se ha encontrado una actividad inmunoestimulante e inmunomodulatoria7,8 y un significativo efecto antipirético, antiviral9,10 y propiedades antimutagénicas in vitro e in vivo.11
Se ha estudiado la mutagenicidad de algunas sustancias químicas empleando la prueba de Ames. Las bacterias empleadas son cepas auxotróficas de Salmonella typhimurium poseedoras de un gen mutante que las hace incapaces de producir histidina en un medio apropiado. Este efecto puede ser revertido con una mutación causada por el agente a estudiar, el cual hace que el gen recupere su función y permita la proliferación de colonias en un medio carente de histidina.11,12 Las cepas de Salmonella typhimurium comúnmente empleadas para este modelo son la TA97A, TA98, TA100, TA102 y TA1535.11 Esta prueba también emplea extracto de hígado de roedores que contienen enzimas capaces de metabolizar el potencial carcinógeno (activación metabólica), causando alteraciones en el ADN, o mutaciones en las bacterias empleadas para este fin o en las células que producirán cáncer en los animales.11,13 Entre los carcinógenos químicos que precisan activación metabólica están los hidrocarburos aromáticos policíclicos y heterocíclicos como el 2-aminoantraceno, benzantraceno, benzopireno, dibenzantraceno, metilcolantreno, 7,12 dimetilbenzantraceno; otros químicos en este grupo son las aminas aromáticas, amidas, azocolorantes, productos vegetales (aflatoxinas, griseofulvina, cicasina), algunos insecticidas y fungicidas, entre otros.11,13,14
El conocimiento de que la "uña de gato" es consumida por miles de personas, que tiene propiedades antioxidantes, antimutagénicas, anticancerígenas e incluso inmunopotenciadoras con un costo bajo y de fácil adquisición, hace que surja como una alternativa terapéutica; por lo que los autores de este trabajo han considerado conveniente ampliar el estudio de sus propiedades, para aportar más evidencias de su efecto antimutagénico y así dar un paso más para el conocimiento de sus bondades. Para esto se planteó el problema siguiente: ¿cuál es el efecto de la U. tomentosa en la mutagénesis de Salmonella typhimurium TA-102 inducida por 7,12 dimetilbenzantraceno (DMBA) con activación metabólica in vitro?
Asumiendo que U. tomentosa, al tener efecto antioxidante y antimutagénico, disminuirá el crecimiento de cepas mutantes de Salmonella typhimurium TA-102 inducidas por 7,12 dimetilbenzantraceno, con activación metabólica in vitro, se propusieron los objetivos siguientes: determinar el efecto del liofilizado de U. tomentosa en la mutagénesis de Salmonella typhimurium TA-102 inducida por 7,12 DMBA con activación metabólica in vitro y obtener las dosis necesarias del extracto liofilizado de U. tomentosa para tener un efecto antimutagénico en cepas mutantes de Salmonella typhimurium (TA-102), inducidas por 7,12 DMBA con activación metabólica in vitro.
MÉTODOS
El estudio se realizó en los ambientes del Laboratorio de Microbiología de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo (Lambayeque, Perú). ]]>
Reconstitución de la cepa
Se emplearon 2 discos liofilizados de Salmonella typhimurium cepa TA-102 (Moltox Inc., USA), los cuales fueron reconstituidos en 25 mL de caldo nutritivo No. 2 con adición de ampicilina (Roussel Labs.) y oxitetraciclina (Pfizer Labs.) a concentraciones de 25 mg/mL y 2 mg/mL, respectivamente, por 12 h a 37 °C; al final se obtuvo una densidad poblacional aproximada de 1 a 2 x 109 células/mL, correspondientes al tubo No. 3 del nefelómetro de Mac Farland. El fenotipo de la cepa fue confirmado mediante la siembra de la muestra en la placa QUAD PC™, suministrado junto con los discos liofilizados.
Reconstitución de microsomas hepáticos
Se empleó liofilizado de microsomas hepáticos (liofilizado S9) de rata Sprague-Dawley (Moltox Inc., USA), rehidratados con agua destilada estéril helada y una solución sobre la base de buffer fosfato 0,2 M pH 7,4; MgCl2 0,4 M; KCl 1,65 M y glucosa-6-fosfato 10 M (reactivo A); finalmente se añadió NADP (reactivo B) al momento de realizar el experimento. Los reactivos A y B provinieron de Moltox Inc. (USA).
Reconstitución del mutágeno ]]>
Se empleó un hidrocarburo aromático policíclico con propiedades mutagénicas conocidas: 7,12 dimetilbenzantraceno (Sigma Labs.,USA) reconstituido con dimetilsulfóxido (DMSO) para una solución de 100 mg/mL.
Material vegetal
Se empleó la corteza de U. tomentosa proporcionada y autenticada por el herbario Weberbauer de la Universidad Nacional Agraria La Molina (Perú), preparada en forma de liofilizado.
Grupos de estudio
El cálculo de la muestra poblacional para cada uno de los grupos en estudio se realizó empleando la fórmula: n= (Za + Zb)2, con un nivel de confiabilidad de 95 %, y considerando un error a y b para una hipótesis unilateral, el valor de n sería 6,16, por lo que cada grupo de estudio fue conformado por 7 unidades de muestra. ]]>
Se emplearon 35 tubos de ensayo, cada uno con: 2 mL de agar histidina/biotina, este medio contiene trazas de histidina que aseguren solo el inicio de algunas divisiones bacterianas; 500 mL de S9 reconstituido, 100 mL del cultivo de la cepa de S. typhimurium TA-102 y 100 mL de la solución mutágena. Se mantuvieron los tubos a 45 °C en baño de María y, según la cantidad de uña de gato recibida, se dividieron en 5 grupos de 7 tubos cada uno: control (0,5 mL de agua bidestilada), grupo experimental A (0,5 mL de solución de extracto liofilizado agua destilada a razón de 0,1 mg/mL), grupo experimental B (0,5 mL de solución de extracto liofilizado agua destilada a razón de 0,2 mg/mL), grupo experimental C (0,5 mL de solución de extracto liofilizado, agua destilada a razón de 1 mg/mL), grupo experimental D (0,5 mL de solución de extracto liofilizado, agua destilada a razón de 1,5 mg/mL).Cada uno de los tubos, luego de su preparación, fue inmediatamente vertido en una placa Petri desechable que contenía agar de glucosa mínima, dejada en una superficie nivelada hasta su solidificación, para luego ser incubadas ambas a 37 °C por 48 h.
Evaluación de los resultados
Luego de 48 h de incubación se realizó el recuento de colonias en cada placa, empleando un contador tipo Quebec con lente de aumento y se registraron los resultados. Se consideró un cultivo positivo (mutante) si el recuento de colonias era mayor que 500 colonias/placa.15 La antimutagenicidad del extracto de uña de gato se expresó como una inhibición porcentual de la mutagenicidad, la cual es manifestada con el crecimiento de colonias y se calcula con la fórmula siguiente:
% inhibición= 100 - [(X1/X2) 100]
Donde X1: número de colonias por placa con presencia del extracto y X2: número de colonia por placa en ausencia del extracto (control).11,16
Análisis estadístico ]]>
Para el análisis estadístico se empleó la t de Student con la finalidad de comparar los promedios del recuento de colonias, se consideró como significativo p< 0,05.
RESULTADOS
El recuento promedio de colonias fue para el grupo control 606,14 ± 21,43 colonias/placa, el grupo A (50 mg/placa) con 528,71 ± 46,52 colonias/placa, el grupo B (100 mg/placa) con 444,71 ± 25,07 colonias/placa, el grupo C (500 mg/placa) con 414,14 ± 49,35 colonias/placa y el grupo D (750 mg/placa) con 333,00 ± 13,73 colonias/placa, tal como se aprecia en la tabla 1.
El grupo control y el experimental A (50 mg/placa) fueron cualitativamente considerados positivos (revertientes), mientras que los grupos B (100 mg/placa), C (500 mg/placa) y D (750 mg/placa) se consideraron negativos (tabla 2), según los criterios de positividad mencionados antes.
En el ensayo realizado se aprecia un aumento progresivo de los porcentajes de inhibición en relación directa con la dosis empleada de extracto liofilizado de U. tomentosa, que llega incluso hasta 45 % con la dosis de 750 mg; así como una relación inversa entre el número de colonias por placa y la dosis empleada del mismo extracto (figs. 1 y 2). ]]>
DISCUSIÓN
El ensayo se realizó de acuerdo con los procedimientos descritos por Maron y Ames,14 bajo estrictas normas de bioseguridad y esterilidad. Todas las placas registraron crecimiento bacteriano y no hubo mayores problemas técnicos durante la ejecución de este trabajo.
Los resultados fueron obtenidos luego de 48 h de incubación mediante el recuento de colonias y previa confirmación del fenotipo de la cepa TA-102. Se encontró un mayor número en el grupo control con respecto a los grupos experimentales tratados con extracto liofilizado de U. tomentosa (tabla 1), con valores superiores a los estudios anteriores con cepas TA-100 expuestos a la acción de los hidrocarburos aromáticos policíclicos.17 Sin embargo, se encuentran valores menores a los hallados por Rizzi, que empleó cepas TA-102 expuestas a la acción de 8-metoxipsoraleno y luz ultravioleta.10 Este valor promedio encontrado fue considerado como control positivo para la mutagénesis, al igual que el promedio hallado con el grupo experimental A, puesto que equivalen al menos 2 veces los valores correspondientes a la tasa de reversión espontánea calculada para la cepa TA-102 en unas 250 colonias/placa,10,14,15 por tanto los valores encontrados en los grupos experimentales B, C y D al final del experimento, están considerados dentro de lo normal (tabla 2). Esto demuestra cualitativamente que el extracto de uña de gato produce una disminución en el número de colonias revertientes y, por ende, hay efecto antimutagénico que lleva el recuento a valores normales a partir del grupo experimental B.
En las figuras 1 y 2 se aprecia que hay una relación inversa entre la dosis empleada de extracto liofilizado de U. tomentosa y el desarrollo de colonias estadísticamente significativo (tabla 1) en todos los grupos tratados con liofilizado de U. tomentosa sin mostrar signos de toxicidad, manifestada como microcolonias "pulverizadas" abundantes.10,14 Las colonias obtenidas eran amarillentas, redondas, del tamaño de una cabeza de alfiler, bien delimitadas, y no hubo crecimiento bacteriano de otro tipo, pues las colonias resultaron homogéneas. Esta relación inversa se explica por un efecto antimutagénico expresado como porcentaje de inhibición del crecimiento de revertientes por placa respecto al grupo control, con valores similares hallados por Rizzi y otros.10 ]]>
La existencia de neoplasias es atribuida, entre otras causas, a la acción mutagénica del oxígeno activo y a los radicales libres,17 el mecanismo de lesión celular mediada por radicales libres es considerado como una vía final común de lesión celular en procesos tan diferentes como lesiones por sustancias químicas y radiactivas, oxígeno y otros gases tóxicos, envejecimiento celular, fagocitosis, inflamación, entre otras. Los radicales libres son sustancias químicas extremadamente activas e inestables que reaccionan con diferentes sustancias orgánicas e inorgánicas, en particular con membranas celulares y ácidos nucleicos. Estos radicales libres son iniciados dentro de las células por radiación, procesos oxidativos o por metabolismo enzimático de otras sustancias. Los más importantes son los radicales derivados del oxígeno, entre los que destacan: radical superóxido (O2-), el peróxido de hidrógeno (H2O2) y los iones hidroxilo (OH-).13Rizzi en su estudio sugirió que la actividad antimutagénica es por causa de la presencia de principios activos en la corteza con efecto antioxidante.10 Posteriormente, Steinberg (1994) postuló que los glicósidos del ácido quinóvico 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7 que se encuentran en la corteza, le confieren esta actividad antimutagénica. Sin embargo, son múltiples los principios activos dentro de la corteza de la U. tomentosa entre los cuales se pueden hallar flavonoides (kaempferol, dihidrokaempferol, 7,7 dihidroflavonol), taninos (protocianidina), saponinas, entre otros. Se ha demostrado que los flavonoides, en especial el kaempferol, al igual que los taninos, tienen efecto antioxidante poderoso frente a diferentes tipos de mutágenos químicos,18-22 con un porcentaje de inhibición en algunos casos de hasta más de 70 %.22
Los hallazgos descritos antes demuestran un efecto antimutagénico de U. tomentosa, basado en principios activos de la corteza (supuestamente flavonoides y taninos), con gran efecto antioxidante. Sin embargo, se resalta que hacen falta muchos más estudios para proporcionar una evidencia más clara del efecto beneficioso del empleo de U. tomentosa como método terapéutico del cáncer, aunque se debe considerar su utilidad en la prevención de este mal.
Se puede concluir del estudio realizado, que el extracto liofilizado de U. tomentosa tiene efecto antimutagénico en la mutagénesis de Salmonella typhimurium TA-102 inducido por 7,12 dimetilbenzantraceno con activación metabólica in vitro, y resulta estadísticamente significativo a partir de 50 mg/placa.
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Recibido: 25 de septiembre de 2007.
Aprobado: 28 de febrero de 2008.
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Dr. Jorge Chin. Hospital Ángeles del Pedregal. Camino a Santa Teresa 1055. Colonia Héroes de Padierna. Torre Hospitalaria, Consultorio 129. C.P. 10700, México D.F. México. Teléf.: 0051 1 4750009. Correo electrónico: jorgechin@hotmail.com Web: www.drchin.com.mx
