ARTÍCULO ORIGINAL
Efecto insecticida in vitro del extracto etanólico de algunas plantas sobre la mosca adulta Haematobia irritans
In vitro insecticidal effect of the ethanolic extract from some plants on the adult fly Haematobia irritans
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MSc. Anastasia Cruz Carrillo, Dr. Carlos E. Rodríguez Molano, Dr. Carlos Ortiz López
Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia. Tunja, Colombia.
Introducción: por el constante desarrollo de resistencia a los grupos de insecticidas comercializados a nivel mundial, en agricultura y ganadería, se ha tenido la necesidad de buscar nuevas alternativas para el control de insectos que además sean seguros para el ecosistema, los animales y el hombre. Desde la medicina popular se reconocen varias plantas con efecto insecticida, pero no se han estudiado por completo.
Objetivos: determinar el efecto insecticida de los extractos etanólicos de 5 plantas Ambrosia cumanensis Kunth, Bidens pilosa L., Brugmansia arborea (L.) Lagerh., Sambucus nigra L. y Nicotiana tabacum L. sobre la mosca adulta Haematobia irritans.
Métodos: los extractos se obtuvieron por el método de extracción Soxhlet y concentrados por medio de un rotoevaporador Buchi; de modo adicional se identificaron los metabolitos secundarios responsables del efecto insecticida con evaluaciones preliminares cualitativas y confirmándose mediante cromatografía en capa fina. Las moscas se capturaron de bovinos parasitados naturalmente. ]]>
Resultados: después de asperjar los extractos diluidos sobre las moscas, se encontró mayor actividad insecticida con Nicotiana tabacum, con un porcentaje de mortalidad de 100, 96,6, 80 y 60 %, con diluciones de 5:10; 2,5:10; 1,25:10 y 0,62:10, respectivamente; seguida por Brugmansia arborea y Sambucus nigra. Los extractos que mostraron menor efectividad resultaron Bidens pilosa y Ambrosia cumanensis.
Conclusiones: bajo las condiciones propuestas en este estudio se demuestra que las 5 plantas tienen acción sobre la mosca Haematobia irritans aunque con diferentes grados de eficacia.
Palabras clave: Ambrosia cumanensis, Bidens pilosa, Brugmansia arborea, Sambucus nigra, Nicotiana tabacum, insecticida.
Introduction: the constant development of resistance to several groups of insecticides marketed worldwide in the fields of agriculture and livestock breeding has led to the urgent search of new alternatives to control insects in a safe way for the ecosystem, the animals and the man. Several plants with insecticidal effect have been recognized in herbal medicine, although they have not been fully studied.
Objectives: to determine the insecticidal effect of ethanolic extracts from five plants, that is, Ambrosia cumanensis Kunth, Bidens pilosa L., Brugmansia arborea (L.) Lagerth., Sambucus nigra L. and Nicotiana tabacum L. on the adult fly Haematobia irritans.
Methods: the extracts were obtained using the Soxhlet extraction methods and then concentrated by the rotoevaporator Buchi; additionally, the secondary metabolites responsible for the insecticidal effect were identified with preliminary qualitative evaluations and confirmed through thin-layer chromatography. The flies were captured from cattle having natural parasites.
Results: after sprinkling the flies with the diluted extracts, the highest insecticidal activity was found in Nicotiana tabacum, with a mortality rate of 100, 96.6, 80 and 60 % at dilution ratios of 5:10; 2.5:10; 1,25:10 and 0.62:10 respectively, followed by Brugmansia arborea and Sambucus nigra. The extracts from Bidens pilosa and Ambrosia cumanensis showed the lowest effectiveness.
Conclusions: under the suggested conditions in this study, it was proved that the five plants had some insecticidal effect on fly Haematobia irritans, but at different levels of effectiveness.
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Key words: Ambrosia cumanensis, Bidens pilosa, Brugmansia arborea, Sambucus nigra, Nicotiana tabacum, insecticide.
INTRODUCCIÓN
Haematobia irritans es un díptero hematófago de la familia Muscidae conocida como "mosca brava" o "mosca de los cuernos". Su presencia se reportó en EE. UU. a finales del siglo pasado procedente de cargamentos de ganado traídos de Europa. Al poco tiempo, era común en las islas del Caribe, donde fue reconocida en 1937 en Venezuela y Colombia.1 Su importancia en producción bovina es económica y sanitaria y se basa en la transmisión de enfermedades, altos niveles de estrés causados por las múltiples picaduras, disminución del apetito, anemia y endurecimiento de la piel, con lo que se altera la calidad del cuero.2 Por lo anterior, se ha creado la necesidad de buscar alternativas de control del ectoparásito, utilizando moléculas con actividad antiparasitaria de origen natural, que a partir del conocimiento popular, exigen la demostración científica de su eficacia.3
En el departamento de Boyacá (Colombia) algunas de las plantas reportadas como insecticidas a través de estudios etnobotánicos son: Bidens pilosa L. ("chipaca" o "amor seco"), a la que se le atribuyen diversas acciones farmacológicas por la presencia de alcaloides y taninos, principalmente;4 Brugmansia arborea (L.) Lagerh. ("borrachero") de la familia de las solanáceas que posee como principal componente la escopolamina y variados alcaloides del grupo tropano.5 Nicotiana tabacum L. (tabaco), es utilizada en diferentes regiones del país gracias a su acción fungicida, insecticida, repelente y acaricida; propiedades atribuidas a su principal componente, la nicotina, metabolito que actúa como una sustancia tóxica de contacto e ingestión; también se han aislado otros constituyentes como N-cafeoliputrescina, tricloroetanol.
Ambrosia cumanensis Kunth, empleada sobre todo para el control de pulgas, chinches y mosquitos. Dentro de sus principales componentes, se encuentran los taninos, inulina, cumarinas, y aceites esenciales producidos en sus partes aéreas. La planta se ha empleado para el control de insectos y plagas en granos almacenados.6 Por último, Sambucus nigra L. se ha reportado como laxante, diurético y estimulante de las defensas del organismo, se dice popularmente que actúa como agente insecticida. Algunos estudios fitoquímicos señalan la presencia de flavonoides, esteroles y alcaloides, al igual que aceites esenciales como ácido cafeico y clorogénico.7
Partiendo del uso que por tradición cultural se ha dado a algunas plantas en ciertas zonas del departamento de Boyacá, con este estudio se buscó determinar su efecto sobre moscas del género Haematobia irritans. ]]>
MÉTODOS
La fase experimental del trabajo se compuso de 3 etapas, la colecta de las plantas y elaboración de los extractos, la colecta de las moscas y el mantenimiento en el laboratorio, así como las pruebas de eficacia insecticida de los extractos diluidos.
Captura de las moscas H. irritans y mantenimiento
Se capturaron empleando una red entomológica, colocándola sobre animales parasitados naturalmente,8 que pastan en la granja la María de la Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia, la cual está ubicada a una altura de 2 690 m sobre el nivel del mar, con una temperatura promedio de 13 °C, y precipitación anual de 600 mL. Luego de ser capturadas las moscas se llevaron a jaulas entomológicas bajo condiciones controladas. Una vez ubicadas dentro del microambiente, se alimentaron con sangre de bovino tratada antes con 5 000 mg de citrato de sodio (anticoagulante) disuelto en 5 mL de agua destilada, con una solución compuesta por 25 mL de agua + 250 000 unidades de nistatina (grado oral) + 0,05 mg de sulfato de kanamicina en polvo, para prevenir el crecimiento de microorganismos.9 Para facilitar el suministro de alimento a las moscas, la sangre se impregnó en toallas higiénicas, las cuales se cambiaron todos los días, con la comprobación previa de que las moscas aceptaban el alimento así suministrado y sobrevivían bajo esas condiciones el tiempo necesario para la realización del estudio. ]]>
Colecta de las plantas y elaboración de extractos
En razón a que este estudio resultó una continuación de los trabajos realizados por otros autores,3,10 las plantas utilizadas fueron chipaca (B. pilosa), altamisa (A. cumanensis), borrachero (B. arborea), sauco (S. nigra) y tabaco (N. tabacum). Se identificaron en el herbario de la Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia y después se utilizaron las hojas frescas de cada una de ellas, las cuales se transportaron en bolsas de papel, al Laboratorio de Control Biológico de esta institución, donde se secaron durante 15 d, bajo cubierta, a temperatura ambiente y en un lugar ventilado para evitar la putrefacción de la muestra.11 Una vez secas, se trituraron manualmente en partículas muy finas hasta alcanzar 1 000 mg de material vegetal.
La obtención de los extractos se realizó en el Laboratorio de Control Biológico de la Escuela de Posgrados de la Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia, mediante una extracción continua de un sólido por un solvente en caliente (Soxhlet).12 En cada equipo se depositó una cantidad aproximada de 30 g de material vegetal y 120 mL de etanol 96 %, en el balón evaporador, el cual fue calentado para que los vapores se condensaran encima de la muestra y se iniciara el proceso de extracción continua, mediante sifonamiento; proceso en el que la solución cae sobre el balón evaporador enriqueciendo así los principios aislados.13 Culminado el proceso de extracción de los compuestos, la solución se llevó al rotaevaporador con el fin de separar el etanol del extracto vegetal y obtener un extracto más puro.14
Con el objeto de comprobar que la extracción resultó eficaz y que realmente se obtuvieron los metabolitos secundarios, responsables del efecto insecticida, se procedió a realizar la identificación cualitativa de los metabolitos presentes en cada uno de los extractos, sometiéndolos a 4 pruebas. Se tomaron 2 mL de cada extracto que se depositaron en tubos de ensayo ubicados en una gradilla, guardando siempre el mismo orden. Se inició con la prueba de Shinoda para la identificación de flavonoides, que se efectuó agregando, en forma lenta, magnesio en limaduras y posteriormente, gotas de ácido clorhídrico; después de 2 min, se esperó un cambio de coloración verde violeta positivo a flavonas en los extractos expuestos. En relación con la identificación de alcaloides, esta se efectuó por medio de la prueba de Drangendorf, empleando un reactivo de precipitación de Drangendorf (yoduro de bismuto y potasio),15 se esperó 2 min, para observar un cambio de coloración roja positiva a alcaloides. A continuación, se procedió a la identificación de cumarinas mediante la reacción de Legal, adicionando una solución de nitroprusiato de sodio 0,5 % y unas gotas de KOH 2N en cada una de las muestras de extracto, y se esperó un cambio de coloración roja, que se interpreta como positiva a cumarinas.16 Por último, se efectuó la reacción de Liebermann Buchard para la identificación de esteroles, sometiendo los extractos a la acción del anhidro acético en cloroformo y ácido sulfúrico concentrado. Las gotas del ácido sulfúrico se agregaron por el borde del tubo de modo muy lento para apreciar un cambio de coloración azul.14
Una vez identificados los metabolitos secundarios, se procedió a realizar una cromatografía en capa fina, con el fin de confirmar la presencia de los metabolitos secundarios identificados en las evaluaciones preliminares. El proceso se hizo en 6 pasos básicos, montaje de las placas, elección del eluyente (cloroformo:metanol, 4:1), siembra, desarrollo, revelado, y determinación del Rf (cociente de la distancia recorrida por el componente patrón y la recorrida por el extracto).16 Para determinar el Rf de los extractos se seleccionaron los respectivos patrones de acuerdo con el metabolito presente en cada extracto;17 es así como para las muestras de B. arborea y A. cumanensis, previa identificación de alcaloides, se utilizó un patrón de referencia de cafeína; para los extractos de B. pilosa y S. nigra previa identificación de esteroles, se utilizó un patrón de colesterol; y para el extracto de N. tabacum, previa identificación de cumarinas, se empleó un patrón de 1-2 benzopirona.14 Por último, las placas se expusieron a revelado por luz ultravioleta para observar manchas fluorescentes en las zonas en las que hay componentes.
Exposición de Haematobia irritans a las distintas diluciones ]]>
Para probar los extractos se utilizó el modelo experimental de mínimas-máximas de efectividad biológica. Debido a que la aplicación de los extractos se hizo con atomizador, no se utilizaron los extractos puros por su viscosidad sino que se realizaron diluciones con agua destilada a partir del extracto puro de cada planta. Se comenzó con una dilución de 5:10. Si con esta dilución se conseguía una mortalidad igual o superior a 60 % (tomada como mínimo eficaz), se disminuía la concentración a la mitad, es decir, 2,5:10, y así sucesivamente hasta que la dilución dejara de mostrar efectividad. Para realizar la prueba de aspersión, se tomaron 7 grupos, grupo control positivo tratado con cipermetrina, grupo control negativo tratado con agua destilada, y 5 grupos tratados con altamisa, chipaca, sauco, borrachero y tabaco, respectivamente. Cada grupo conformado por 10 moscas y con 3 repeticiones cada uno, es decir, se trabajó con un total de 30 moscas por prueba. Por último la mortalidad se determinó a las 24 h posaspersión.
Valoraciones y análisis estadístico
Para establecer la eficacia de los extractos se determinó el porcentaje de mortalidad utilizando la fórmula siguiente:
Para el análisis estadístico se empleó un diseño completamente al azar, y el método de comparación de 2 proporciones, para determinar el intervalo de confianza, usando la inferencia sobre una proporción, donde se toma el número de casos (moscas muertas por prueba) sobre el tamaño de la muestra, usando el programa EPIDAT, programa para el análisis epidemiológico de datos tabulados versión 3.0., el cual cuenta con un nivel de confianza de 95 %. ]]>
RESULTADOS
Obtención de extractos
Se obtuvieron 60 mL de extracto etanólico por cada planta con características diferentes. Los extractos de altamisa y sauco fueron de color verde oscuro, el primero con olor mentolado y consistencia líquida y el segundo semilíquida. Borrachero y chipaca resultaron de color verde claro, de consistencia líquida y de olor agrio y mentolado, respectivamente. El tabaco fue café oscuro, de olor característico y consistencia semilíquida.
Análisis preliminar de metabolitos secundarios
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En la prueba de Shinoda para la identificación de flavonas, el extracto de B. pilosa resultó el único que presentó un cambio de coloración verde violeta. Para la evaluación colorimétrica de Drangendorff se presentó un cambio de coloración rojo-marrón, positivo a alcaloides, en los extractos de B. pilosa, B. arborea, S. nigra y N. tabacum. En la reacción de Legal para el análisis preliminar de cumarinas, la única muestra positiva fue el extracto etanólico de N. tabacum. En la reacción de Liebermann Buchard se encontraron esteroles en los extractos de B. pilosa y S. nigra.
Resultados cromatografía en capa delgada
Los extractos etanólicos de B. arborea y A. cumanensis tuvieron un Rf de 0,62 y 0,52, respectivamente, frente a un Rf patrón de cafeína de 0,7; lo que indica la presencia de alcaloides sobre la placa y su proporción en ella, que para este estudio se consideró buena. Para los extractos etanólicos de B. pilosa y S. nigra se obtuvieron Rf de 0,6 y 0,49, respectivamente, frente a su Rf patrón de colesterol de 0.72, indicando la presencia abundante de esteroles en el extracto de B. pilosa y moderada en el extracto de S. nigra. Por último, en la cromatografía de N. tabacum se obtuvo un Rf de 0,59 frente a su Rf patrón de benzopirona de 0,8, lo que confirmó la presencia de cumarinas en alta proporción en la placa.
Resultados prueba de aspersión sobre H. irritans
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A partir del extracto etanólico de B. arborea ("borrachero"), se prepararon 4 diluciones, 5:10, 2.5:10, 1,25:10 y 0,62:10, con las que se consiguieron mortalidades de 90, 83,3, 70 y 60 %, respectivamente. Para la dilución siguiente 0.31:10 se presentó un porcentaje de mortalidad de 13,3 %, que se interpreta como ineficaz (tabla).En el grupo de moscas expuestas al extracto etanólico de B. pilosa solo las 2 primeras diluciones mostraron eficacia sobre H. irritans, con una mortalidad de 76,6 y 70 %. En el caso del extracto de S. nigra en encontró eficacia insecticida con las 3 primeras diluciones, con mortalidades por encima de 76 % (tabla).
Las diluciones con extracto etanólico de tabaco mostraron los niveles de mortalidad más altos contra H. irritans (tabla).
DISCUSIÓN
Como se dijo antes, en este estudio se demostró la presencia de flavonas en los extractos de B. pilosa, lo cual concuerda con la literatura, en la que se indica que uno de los principales metabolitos de esta planta corresponde a estos compuestos y, a partir de ello, se han identificado algunos efectos medicinales como son antineoplásicos, antifibróticos hepáticos, antifúngicos.18-20
En este estudio tanto en la prueba preliminares como en las cromatográficas, se demostró la presencia de alcaloides en los extractos de B. pilosa, B. arborea, S. nigra y N. tabacum, resultado esperado, considerando los reportes de la literatura que indican, como uno de los principales compuestos de estas plantas, diversos tipos de alcaloides. Los alcaloides se encuentran principalmente en las hojas de la planta aunque también en otras partes de esta.3,20 Alcaloides tropánicos se encuentran en el "borrachero", los derivados del ácido nicotínico en el tabaco,21 y la sambucina y sambucigrina son los alcaloides encontrados en al sauco.22 En la reacción de Legal para el análisis preliminar de cumarinas, la única muestra positiva fue el extracto etanólico, de N. tabacum, lo cual concuerda con los reportes de fitofarmacología que indican que esta planta posee derivados cumarínicos como aesculetín, trimetil-naftaquinona, escopoletín y escopolín,23 esto se corroboró en la cromatografía. De manera concordante a lo indicado en la literatura, en los extractos de B. pilosa y S. nigra se evidenció la presencia de fitoesteroles, que según la prueba cromatográfica resultó mayor en la primera y menor para la segunda. Estos compuestos corresponden a esteroides naturales derivados del ciclopentano-perhidrofentantreno con 24 a 27 carbonos en su estructura, presentes en la membrana celular de algunas plantas.24,25
Todos los extractos fueron eficaces en la primera dilución y ninguno mostró eficacia en diluciones mayores que 0,31:10; comportamiento que respalda uno de los principios de la actividad farmacológica que determina mayor efecto con mayor concentración de principios activos.26-28 ]]>
Considerando el efecto insecticida observado en este estudio, en la B. arbórea resultó concordante con el estudio de Ramírez y otros,3 en el que se evaluaron las mismas plantas pero el extracto se obtuvo por el método de lixiviación en frío. A pesar de que en términos generales la eficacia resultó igual, los porcentajes de mortalidad alcanzados fueron menores en el presente estudio. El efecto insecticida también había sido reportado para esta planta, en otro estudio en el que se utilizó contra Plutella xylostella, un insecto que ataca ciertos cultivos.10 Se reconoce que por la presencia en esta planta de alcaloides con acción en el sistema nervioso central y periférico, hay efecto insecticida, que puede verse afectado por diferentes razones. Es así como el proceso de secado de las hojas parece disminuir la eficacia de esta planta sobre el díptero Eupalamides cyparissias (Lepodiptera: Castniidae), insecto propio de Sur América, que parasita la palma aceitera Elaeis guineensis, como lo demuestran algunas investigaciones.29En el presente estudio se corrobora el efecto insecticida de la B. pilosa sobre la H. irritans ya reportado en otro trabajo,3 en el que utilizaron extracto alcohólico en frío; aunque para esta planta la eficacia fue notoriamente mayor con el extracto en caliente, lo cual permite suponer que en este caso, el calor al que es sometido el material vegetal, favorece la extracción de los metabolitos activos. Igualmente, el efecto insecticida aquí encontrado concuerda con la eficacia demostrada de la planta sobre el gorgojo Stegobium paniceum, parásito del maíz.30 Contrario a lo antes mencionado, y a diferencia del efecto insecticida encontrado en este estudio, en el trabajo desarrollado por Iannacone y otros, no se encontró acción contra el gorgojo del maíz, Sitophilus motschulsky y Stegobium paniceum, lo que indica que el efecto insecticida demostrado en una especie de insecto no implica que sea eficaz contra todos; esto hace necesario evaluar cada especie por separado, así como determinar el extracto más eficaz en cada caso.
Comparando la eficacia insecticida del extracto etanólico de S. nigra obtenido en caliente con el mismo obtenido en frio,3 se encontró que esta fue mayor con el primero, mostrando esta planta un comportamiento similar a la planta anterior, que se explica con una mejor extracción de los metabolitos activos bajo condiciones de mayor temperatura. A pesar de los hallazgos del presente estudio, esta planta suele reportarse como medicinal, pero para el tratamiento de enfermedades inflamatorias y reumatoideas debido a la presencia del alcaloide sambucina y por la presencia de flavonoides se reporta efecto diurético.31 Es así como se encuentran pocos reportes de efecto insecticida.
De las 5 plantas evaluadas en este estudio, la N. tabacum (tabaco) fue la que mostró mayor eficacia contra la mosca H. iritans, lo cual concuerda con otros estudios, a través de los cuales se demuestra su efecto no solo insecticida sino también ixodicida;3,10 así mismo se ha demostrado que actúa contra Culex quinquefasciatus say (Diptera:culicidae)29 y contra varias especies de insectos que afectan cultivos.32,33 El efecto antiparasitario del tabaco se debe a la presencia de nicotina, la cual muestra afinidad por los receptores colinérgicos-nicotínicos, a los que estimula generando parálisis sostenida y muerte.32
En consecuencia, en relación con la eficacia de los extractos alcohólicos de las 5 plantas evaluadas contra la H. irritans, bajo las condiciones aquí planteadas, se encontró que esta fue mayor con la N. tabacum, seguida de B. arborea y S. nigra, y con menor eficacia B. pilosa y A. cumanensis; la eficacia, en todos los casos, resultó directamente proporcional a la concentración del extracto. Igualmente se halló que el efecto contra la mosca fue mayor con los extractos obtenidos mediante la técnica Sohxlet que con lixiviación en frío.
AGRADECIMIENTOS
El trabajo fue financiado parcialmente por investigadores y por la institución.
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Recibido: 21 de diciembre de 2010.
Aprobado: 21 de mayo de 2011.
Anastasia Cruz Carrillo. Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia. Tunja, Colombia. Teléf.: 3004669408. Correo electrónico: anastasia.cruz@uptc.edu.co; anicata22@hotmail.com ]]>
