Marcadores moleculares de tipo inserción en bacterias de las familias Moraxellaceae y Helicobacteraceae (phylum Proteobacteria)

Molecular markers of insertion type in bacterias of the Moraxellaceae and Helicobacteraceae (phylum Proteobacteria) families

Lic. Ania Margarita Cutiño Jiménez, ^I Lic. Lianne Barrera Roca, ^I Lic. Vivian de la Puente López ^II y Dra. Heidy Annia Peña Cutiño ^III

^I Facultad de Ciencias Naturales y Exactas, Universidad de Oriente, Santiago de Cuba, Cuba. ]]> ^II Centro Nacional de Electromagnetismo Aplicado, Universidad de Oriente, Santiago de Cuba, Cuba.
^III Clínica Estomatológica "Fé Dora", Santiago de Cuba, Cuba.

RESUMEN

Se efectuó un estudio con el empleo de la metodología de Gupta, en el Departamento de Biología y Geografía de la Universidad de Oriente en Santiago de Cuba, para determinar marcadores moleculares de tipo inserción en secuencias de las proteínas ADN polimerasa I y ADN polimerasa III (subunidad alfa), obtenidas de bases de datos internacionales y posteriormente alineadas con el programa ClustalX2. Las familias Moraxellaceae y Helicobacteraceae han sido ampliamente estudiadas, porque comprenden agentes patógenos causantes de numerosas enfermedades en humanos, pero pocas investigaciones han estado dirigidas a la identificación de las características moleculares que puedan distinguir a sus miembros de otros grupos de bacterias; de manera que los presentes resultados constituyen un aporte al conocimiento de la genética y la bioquímica de estas familias y proveen herramientas moleculares para la clasificación taxonómica y el diagnóstico de especies patógenas.

Palabras clave: marcadores moleculares, Moraxellaceae, Helicobacteraceae, Moraxella, Acinetobacter, Psychrobacter, Helicobacter, ADN polimerasa I, ADN polimerasa III.

ABSTRACT

A study with the use of Gupta methodology was carried out in the Biology and Geography Department of Oriente University in Santiago de Cuba, to determine molecular markers of insertion type in sequences of the DNA polimerase I proteins and DNA polimerase III (alpha subunity), obtained from international databases and later on aligned with the ClustalX2 program. The Moraxellaceae and Helicobacteraceae families have been broadly studied, because they comprise pathogen agents that cause numerous diseases in humans, but few investigations have been directed to the identification of the molecular characteristics that can distinguish their members from other groups of bacterias; so these results constitute a contribution to the knowledge of genetics and biochemistry of these families and provide molecular tools for the taxonomic classification and the diagnosis of pathogen species.

Key words: molecular markers, Moraxellaceae, Helicobacteraceae, Moraxella, Acinetobacter, Psychrobacter, Helicobacter, DNA polimerase I, DNA polimerase III.

INTRODUCCIÓN

La familia Moraxellaceae, incluida en la clase Gammaproteobacteria, comprende a los géneros Moraxella, Acinetobacter y Psychrobacter. Algunas especies de Moraxella son importantes en el contexto de la medicina, por ser parásitas de las membranas mucosas del hombre y de otros mamíferos. Asimismo la especie Psychrobacter immobilis y varias cepas de Acinetobacter han sido registradas como agentes patógenos oportunistas, causantes de numerosas infecciones intrahospitalarias.^1-4

En la clase Epsilonproteobacteria se encuentra la familia Helicobacteraceae, que incluye el género Helicobacter.⁵ La bacteria Helicobacter pylori es el agente causal reconocido de varias enfermedades gastrointestinales en el hombre, como la gastritis crónica, las úlceras pépticas, el adenocarcinoma de estómago y el linfoma de tejido linfoide asociado a la mucosa gástrica.⁶

A pesar de que las familias Moraxellaceae y Helicobacteraceae han sido ampliamente estudiadas, pocas investigaciones han estado dirigidas a la determinación de marcadores moleculares para el diagnóstico de las especies patógenas que estas contienen.

La disponibilidad de genomas y proteomas completamente secuenciados para un gran número de bacterias, constituye una oportunidad para la taxonomía y el diagnóstico molecular. De acuerdo con la metodología propuesta por Gupta, la comparación de secuencias de proteínas de diferentes especies mediante el alineamiento múltiple, permite hallar marcadores moleculares que pueden ser empleados en la identificación de bacterias.⁷

Teniendo en cuenta que ambas familias comprenden especies de importancia en el ámbito médico, el presente estudio se basó en la mencionada metodología para la determinación de inserciones en proteínas relacionadas con el metabolismo del ácido desoxirribonucleico (ADN), que constituyan marcadores moleculares en la taxonomía y diagnóstico de especies patógenas.

MÉTODOS ]]> La investigación se llevó a cabo en el Departamento de Biología y Geografía de la Universidad de Oriente en Santiago de Cuba y para ello fueron escogidas secuencias de las proteínas ADN polimerasa III (subunidad alfa) y ADN polimerasa I pertenecientes a especies del phylum Proteobacteria, obtenidas de bases de datos internacionales a partir del servidor National Center of Biotechnology Information. Posteriormente fueron comparadas mediante el programa ClustalX2,⁸ considerando los parámetros sugeridos por Hall: alineamiento par a par (apertura de gap 35 y extensión de gap 0,75) y alineamiento múltiple (apertura de gap 15 y extensión de gap 0,30).⁹

Los alineamientos obtenidos fueron analizados mediante una inspección visual para identificar las inserciones, de las cuales se consideraron relevantes aquellas que estuvieran flanqueadas por regiones conservadas, como fue propuesto por Gupta.⁷

La lista de las especies incluidas con su nomenclatura correspondiente es mostrada en el anexo. En cada figura la nomenclatura es seguida por el número de acceso de la secuencia en la base de datos. Los puntos muestran identidad con el aminoácido de la primera secuencia en el alineamiento y los guiones (-) representan brechas que indican ausencia de la inserción, que está señalada por un cuadro.

RESULTADOS

La figura 1 muestra una inserción de 11 aminoácidos en la proteína ADN polimerasa I, característica de los géneros Psychrobacter y Moraxella, pero ausente en el género Acinetobacter de la familia Moraxellaceae.

El alineamiento de la proteína ADN polimerasa III (subunidad alfa) evidenció una inserción de un aminoácido exclusivo del género Acinetobacter (figura 2), además de otra inserción de 4 a 17, característica de algunas especies de Helicobacter (figura 3).

DISCUSIÓN

La inserción compartida por los géneros Psychrobacter y Moraxella está bien conservada en las secuencias de las especies de Psychrobacter, lo que permite diferenciarlas de las especies de Moraxella. Las especies patógenas M. catarrhalis y M. nonliquefaciens han sido aisladas en humanos a partir de la cavidad nasal y de muestras del tracto respiratorio de pacientes con bronquitis crónica y otras infecciones de las vías respiratorias;¹⁰ un número significativo de sus cepas producen beta-lactamasa, lo que ha condicionado su resurgimiento como agentes patógenos en este tipo de infecciones.² ]]> Igualmente la inserción exclusiva de un aminoácido en Acinetobacter en la proteína ADN polimerasa III (subunidad alfa) resulta de gran valor para la taxonomía e identificación a nivel de género. Entre las especies que la presentan está el A. baumanii, que ha emergido como uno de los microorganismos hospitalarios de mayor relevancia a escala mundial.⁴ Existe una clara asociación entre la infección por estas bacterias y el uso de instrumentales hospitalarios, y las infecciones resultan en septicemias, meningitis, endocarditis, neumonías e infecciones del tracto urinario. Algunas cepas aisladas en Cuba han mostrado resistencia a múltiples antibióticos, como la ampicilina, gentamicina, amikacina y ciprofloxacina.¹¹

Muchas especies de Helicobacter son patógenas del hombre y están asociadas a tres enfermedades, generalmente relacionadas con su nicho ecológico natural.¹² Entre las especies que comparten la inserción de 5 aminoácidos en la proteína ADN polimerasa III (subunidad alfa) está el H. pylori, reconocida como la principal bacteria causante de úlceras pépticas, gastritis atrófica y cáncer gástrico.^5,13 Es importante señalar que la inserción permite una distinción de esta especie debido a que la secuencia de aminoácidos difiere en la cuarta posición respecto a la H. cetorum, que también la presenta.

La inserción es de 17 aminoácidos en 3 de las especies de Helicobacter: H. pametensis, H. typhlonius y H. hepaticus; las dos últimas comparten las mismas secuencias de aminoácidos, lo que resulta de gran valor desde el punto de vista médico, puesto que el H. heilmannii ha sido aislado de las muestras tomadas de pacientes con gastroenteritis.¹⁴

Hay que señalar que las especies entéricas de Helicobacter no son frecuentemente notificadas como agentes causales de enfermedades en humanos, pero su incidencia pudiera estar significativamente subestimada, debido a los inadecuados procedimientos de aislamiento e identificación.¹³ Considerando las dificultades en la identificación de especies comprendidas en este género y dada la importancia clínica de algunas de ellas, la determinación de marcadores moleculares específicos de este importante grupo resultaría de gran relevancia para la medicina.

La metodología desarrollada por Gupta ha sido utilizada por otros autores en el análisis de diferentes grupos de bacterias.^15,16 Las inserciones halladas en este estudio constituyen una herramienta molecular útil para el diseño de protocolos de diagnóstico que permitirán establecer futuras estrategias respecto a la epidemiología y el tratamiento en enfermedades ocasionadas por dichos agentes patógenos. No existen informes previos de marcadores distintivos para las bacterias antes mencionadas, por lo que estos resultados no solo aportan el conocimiento de su biología y bioquímica, sino que pudieran considerarse útiles para la taxonomía, el diagnóstico y la descripción de nuevas especies.

Para concluir, el análisis de las proteínas mediante el alineamiento de secuencias de proteobacterias, permitió la identificación de inserciones útiles en la clasificación taxonómica, que constituyen marcadores moleculares para el diagnóstico de especies de las familias Moraxellaceae y Helicobacteraceae; tema de gran importancia para la protección de la salud humana.

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Ania Margarita Cutiño Jiménez. Universidad de Oriente, Patricio Lumumba s/n esq. Avenida Las Américas, Santiago de Cuba, Cuba. Correo electrónico:aniacutino@uo.edu.cu

Anexo.  Lista de las especies incluidas en el estudio con su nomenclatura

]]> 1 2014 443-76 2 2014 70 3 3 280-8 3 2012 62 671-4 4 2014 34 101-7 5 2014 337-92 6 2010 19 2 2 4 7 2014 153-82 8 2007 23 21 21 2947-8 9 2005 22 3 3 792-802 10 2014 14 1 1 583 11 2013 15 2 2 26-9 12 2016 20 11 11 2339-44 13 2013 11 6 6 385 14 2014 20 47 47 17779-87 15 2014 28 182-98 16 2016 39 7 7 453-63