Efecto antioxidante de la Chuquiraga jussieui J. F. Gmel en el ensayo de hemólisis
Antioxidant effect of the Chuquiraga jussieui J. F. Gmel using the hemolysis test
MSc. Alex Alberto Dueñas Rivadeneira1, MSc. Ulbio Eduardo Alcívar Cedeño2, Dr. C. Ervelio Olazábal Manso3, Dr. C. Remigio Cortés Rodríguez4
1. Máster en Investigación Educativa. Docente Agregado. Universidad Técnica de Manabí, Portoviejo, Manabí. Ecuador. Correo electrónico: alduri81@hotmail.com
2. Máster en Administración Ambiental. Docente Auxiliar. Universidad Técnica de Manabí, Portoviejo, Manabí. Ecuador. Correo electrónico: ulbioalcivar@gmail.com ]]>
3. Doctor en Ciencias Veterinarias. Profesor Auxiliar. Centro de Bioactivos Químicos. Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas. Santa Clara, Villa Clara. Cuba. Correo electrónico: ervelio@uclv.edu.cu
4. Doctor en Ciencias Farmacéuticas. Profesor Auxiliar. Centro de Bioactivos Químicos. Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas. Santa Clara, Villa Clara. Cuba. Correo electrónico: remigio@uclv.edu.cu
RESUMEN
Se realizó la evaluación del efecto hemolítico y antioxidante del extracto acuoso de la Chuquiraga jussieui utilizando el ensayo de hemólisis del eritrocito humano producido por el dodecilsulfato de sodio. Se evaluaron cinco concentraciones del extracto (7,5, 15, 30, 60 y 120 mg/L). Se validó el efecto hemolítico producido por el dodecilsulfato en una solución que contiene eritrocitos, dodecilsulfato de sodio y solución amortiguadora fosfato salino; se obtuvo la concentración de hemoglobina en la suspensión utilizando espectroscopia ultravioleta visible, y se determinó el efecto antioxidante del extracto de Chuquiraga jussieui. Se obtuvo una concentración de hemoglobina media (CH50) del dodecilsulfato de sodio de 35,35 mg/L; mientras que para el extracto de Chuquiraga jussieui, la CI50 fue de 64,89 mg/L y la CI90 fue de 86,96 mg/L. Estos resultados sugieren la posible utilización del extracto de esta planta como antioxidante.
DeCS: extractos, antioxidantes, hemólisis, eritrocitos, hemoglobinas.
ABSTRACT
The evaluation of the hemolytic and antioxidant effect of the aqueous extract of C. jussieui was carried out using the hemolysis test with the human erythrocyte produced by the sodium dodecyl sulphate (SDS). Five concentrations of the extract (7, 5, 15, 30, 60 and 120 mg/L) were evaluated. The hemolytic effect produced by the dodecyl sulphate was validated in a solution that contains erythrocytes, SDS and phosphate-buffered saline (PBS), and the hemoglobin concentration was obtained in the suspension using ultraviolet- visible spectroscopy (UV-Vis), the one that was used to determine the antioxidant effect of the extract of C. jussieui. The average concentration of hemoglobin (CH50) of SDS obtained was of 35,35 mg/L; while for the extract of C. jussieui, the (CI50) was of 64,89 mg/L and the (CI90) was of 86,96 mg/L. These results suggest the possible use of the extract of this plant as an antioxidant.
DeCS: plant extracts, antioxidants, hemolysis, erythrocytes, hemoglobins.
INTRODUCCIÓN
Las dietas ricas en plantas pueden ser beneficiosas para el hombre con respecto a la prevención de enfermedades, por lo cual existen muchas personas que individualmente dependen de productos de plantas con propósitos medicinales. No es por tanto inesperado, que la mayoría de las personas tengan fe en el uso de drogas de origen vegetal,1 debido a que son baratas, fácilmente disponibles y suelen ser más eficaces.2 Actualmente, hay un interés cada vez mayor en la comunidad de investigadores de profundizar en las bases científicas de la utilidad de muchas plantas o hierbas, ya que la mayoría de ellas todavía no han sido utilizadas en relación con la bioactividad demostrada.3
El género Chuquiraga se encuentra localizado en el Ecuador y varios países más de América del Sur, y es considerada una planta con varios efectos medicinales y actividad antioxidante. La infusión de tallos y hojas de Chuquiraga spinosa (R&P), se utiliza por sus propiedades antiinflamatorias y para el tratamiento de infecciones vaginales. Existe un estudio que evaluó la actividad antioxidante, antiinflamatoria y actividades antifúngicas de C. spinosa.4
Los extractos metanólicos de Chuquiraga straminea Sandwith, subfamilia Barnadesioideae (Asteraceae), mostraron la presencia de un grupo de flavonoides y fenoles totales con actividad antioxidante.5 La Chuquiraga atacamensis, que crece en la región Puna de Argentina (3 800 msnm), es utilizada para reducir el estrés oxidativo y aliviar la gota y el dolor artrítico; los extractos de las partes aéreas de la planta fueron evaluados y estandarizados en términos de contenido de compuestos fenólicos, de flavonoides y de la actividad captadora de los radicales libres.6
Por otra parte, los eritrocitos son muy propensos al ataque de especies reactivas de oxígeno (ROS), debido a la alta cantidad de contenido de ácido graso poliinsaturado en sus membranas y a las reacciones de oxidación, debido al Fe de la hemoglobina. El ataque oxidativo de los eritrocitos es uno de los sucesos más importantes en algunas hemoglobinopatías.7 La autoxidación de la oxihemoglobina contribuye a la degradación de núcleo hemo, por lo que el daño inducido experimentalmente al eritrocito es un buen modelo de investigación.8 Los fitoquímicos pueden proteger los eritrocitos o incrementar su resistencia a las reacciones oxidativas.9
La Chuquiraga jussieui J.F. Gmel no ha sido evaluada como antioxidante; por ello, el objetivo del presente trabajo fue determinar la capacidad antioxidante en eritrocitos humanos in vitro de los extractos de hojas y tallos de esta planta para interferir la acción del dodecilsulfato de sodio (SDS) como inductor de la peroxidación lipídica del eritrocito, su efecto hemolítico, liberación de hemoglobina y oxidación.
MÉTODOS
]]> Este estudio experimental fue realizado en los laboratorios del Departamento Biológico del Centro de Bioactivos Químicos en la Universidad Central de las Villas, en junio de 2013; el equipo utilizado para realizar los análisis fue un espectro-fotómetro UV/VIS, Marca Camp Spec, con ancho de banda de +/- 1 nm, integración de 1s, celdas de 1 cm de espesor.El material de la corteza de las hojas y tallos de Chuquiraga jussieui se secó al aire, hasta obtener un peso constante en el laboratorio. El material seco se pasó por un molino de cuchillas y, posteriormente, por un tamiz de 0,315 mm de acero inoxidable para convertirlo en un sólido pulverulento (SP), de tamaño de partícula uniforme, que se almacenó en una bolsa de plástico sellada herméticamente para su uso posterior. Para realizar el ensayo, se pesaron 20 gramos del SP y se adicionaron a 1 L de agua destilada a 100ºC en un beaker por un tiempo de 10 minutos. Este extracto fue utilizado para realizar los ensayos, y se calculó que estaba a una concentración del 2 % del SP.
Se utilizó la metodología de preparación de los glóbulos rojos (GR) referida por Pape y Hope10 con algunas reformas que se describen a continuación:
Se obtuvo sangre humana de voluntarios sanos, en viales de polietileno con EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) como anticoagulante; a continuación, se separaron los GR centrifugando a 1500 rpm durante 15 minutos. El paquete de GR obtenido se lavó tres veces en solución amortiguadora fosfato salino (PBS). Los GR limpios se mezclaron con PBS en proporción 1:1. Esta suspensión se almacenó a 8ºC, durante tres días como máximo.
Previamente a los ensayos de hemólisis y desnaturalización, se ajustó mediante espectrofotómetro la concentración de oxihemoglobina (HbO2) en la suspensión de trabajo a un valor de 0,122 ± 0,003 mmol/L, ajustando con PBS los eritrocitos lavados en la suspensión, la cual se preparó diariamente.
Ajuste de la concentración de hemólisis con SDS
Diferentes concentraciones de SDS (5, 10, 20, 40, 80, 100, 200, 400, 800, 1000 ppm) se utilizaron para mezclarla con la suspensión de eritrocitos, a razón de 1:40, en agitación continua y a temperatura de 25oC. El proceso de incubación fue detenido centrifugando a 10 000 rpm en microcentrífuga Eppendorf y, posteriormente, separando el sobrenadante y determinando en él la concentración de HbO2 a 540 nm. Este ensayo se repitió con las mismas características para la evaluación del efecto hemolítico de C. jussieui.
La concentración hemolítica media (CH50) se obtuvo teniendo en cuenta el porcentaje de la hemoglobina liberada en el medio de ensayo, originada por las diferentes concentraciones del producto evaluado y calculada como porcentaje de la liberación de hemoglobina tomada como 100 %.
La C. jussieui se evaluó en concentraciones desde 0-120 mg/L en cinco concentraciones diferentes ((7,5, 15, 30, 60, 120). El porcentaje de hemólisis se calculó utilizando la siguiente fórmula:
% hemólisis = A/B*100.
]]> Donde: A = Absorbancia de la muestra (eritrocitos 20 % en PBS), más extracto (diferentes concentraciones).B = Absorbancia de la muestra (eritrocitos 20 % en PBS) más 74 mM de SDS (0,856). El efecto de inhibición de la hemólisis se calculó utilizando la siguiente fórmula:% inhibición de la hemólisis = 100-((A/B)*100)
Controles
Se utilizaron como controles de hemólisis con eritrocitos y agua destilada para hemólisis espontánea, eritrocitos y PBS, y eritrocitos y SDS (1 %), todos a razón de 1:40. Se utilizó ácido ascórbico (Sigma-Aldrich) como patrón de sustancia antioxidante, después de calcular su CI50 por el método de regresión lineal.11
La validación de la metodología analítica se realizó sobre la base de la respuesta directamente proporcional a la concentración del analito, la repetibilidad y precisión intermedia. Para el grado de respuesta a la concentración del analito, se corroboró el coeficiente de regresión (R2) entre la absorbancia de HbO2 y su concentración. Se evaluó la repetibilidad desarrollando la metodología completa en un mismo día, con los mismos reactivos y el mismo analista, utilizando la prueba C de Cochran. Se verificó la precisión intermedia a través de la evaluación de la diferencia estadística de los resultados obtenidos al desarrollar la metodología con tres repeticiones, diferentes días y analista. Se utilizó el análisis estadístico ANOVA como método de evaluación de los resultados (fueron verificados el cumplimiento de los supuestos para la realización del ANOVA).
RESULTADOS
Los ajustes de HbO2 liberada al mezclar el agua destilada con la suspensión de ensayo de los GR, estuvieron dentro de los parámetros de absorbancia declarados para el equipo. El máximo de absorbancia encontrado correspondió a la liberación máxima de hemoglobina, lo que permitió ajustar la concentración de GR a 0,122 mmol/L.
En el gráfico 1, se aprecia el efecto de las diferentes concentraciones de SDS sobre los GR. El aumento de las concentraciones de SDS corresponde con una elevación de la hemólisis, que continúa hasta la concentración de 85 ppm, a partir de la cual manifiesta un efecto de descenso, congruente con un proceso de desnaturalización de las proteínas, hasta que no hubo más proteínas por desnaturalizar.
]]> Los valores de inhibición de la hemólisis (mg/L) del extracto de C. jussieui fueron CI50 64,89 y CI90 86,96.Los valores de inhibición de la hemólisis (mg/L) del ácido ascórbico (vitamina C) fueron CI50 55,82 y CI90 83,20.
En la Tabla 1 y Tabla 2, se puede observar que la verificación de la varianza resultó no significativa, dado que la significación (p) fue muy superior a 0,05, lo que demuestra la homogeneidad de las varianzas entre las diferentes repeticiones para cada concentración.
En el ensayo de efecto antioxidante, las concentraciones de los extractos de C. jussieui demostraron una alta capacidad de inhibición de la hemólisis, pues se encontró que esta produjo valores de inhibición de la hemólisis con CI50 de 64,89 y CI90 de 86,96 mg/L con su extracto. Mientras que la vitamina C tuvo una CI50 de 55,82 y una CI90 de 83,20, lo que se corresponde con una correlación positiva de los valores de absorbancia determinados.
Entre los diferentes modelos analizados en el ajuste de los datos, el más adecuado resultó ser el modelo logarítmico que se muestra en los gráficos 2 y gráfico 3, donde se informan los valores experimentales del análisis de regresión entre las variables dependientes y las independientes (R2 = 0,9503) en el gráfico 2 y (R2 = 0,9825) en el gráfico 3. Los resultados descritos anteriormente reafirman que las concentraciones de las sustancias evaluadas en este ensayo tienen un efecto directamente proporcional a la concentración.
La prueba C de Cochran, que se aplicó para los resultados de esta investigación, indicó la existencia de varianzas semejantes (Cochran 0,31 con valor de p = 1,0). Esto evidencia que la varianza de los resultados es independiente de la concentración de la muestra, lo que indica una buena repetibilidad de los resultados.
]]>DISCUSIÓN
Aunque los experimentos de evaluación in vitro con eritrocitos no son tan reales como los ensayos in vivo, dado que no existen enzimas y otros elementos que pueden interferir en las reacciones desarrolladas con los productos de experimentación, sí ofrecen resultados que permiten un grado de confiabilidad para desarrollar otras verificaciones más complejas. También permiten definir, en este caso, si el producto evaluado tiene perspectivas como antioxidante, y aquí radica la importancia de esta investigación, que aporta resultados a favor de la profundización de estudios sobre el mecanismo de acción de la C. jussieui como antioxidante, dado que este presentó una concentración inhibitoria aceptable.
La relación dosis-respuesta establecida en la hemólisis producida por el SDS permitió el cálculo de una CH50 con 35,35 ppm. En otros ensayos realizados para determinar la CH50 del SDS, Pape y Hope10 informaron 29,0 ppm, y Martínez12 obtuvo 43,6 ppm. Los resultados que se informan en el presente trabajo están dentro del rango obtenido por estos investigadores. Se atribuye que las diferencias existentes entre los resultados pudieron ser ocasionadas por las condiciones experimentales de cada laboratorio.
Se ha señalado que la hemólisis producida por el SDS puede ocurrir debido a la acción de moléculas con carga negativa en el surfactante y los fosfolípidos de la membrana del eritrocito, que ocasionan, entre otras reacciones, una peroxidación lipídica,13 y permite la salida de la hemoglobina de los GR, que por sus características químicas, puede ser determinada con el espectrofotómetro UV/VIS.14 Todo ello permitió establecer el principio del ensayo de eritrocitos para la determinación de hemólisis.
Al enfrentar diferentes concentraciones de C. jussieui a una solución de eritrocitos, no se encontró que tuviera efecto hemolítico, lo que permitió continuar con la evaluación de su efecto antioxidante.
De lo anteriormente analizado, se concluye que la Chuquiraga jussieui demostró propiedades antioxidantes, al inhibir la hemólisis de los eritrocitos (CI50 = 64,89 mg/L) en este ensayo.
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Recibido: 14 de diciembre de 2013
Aprobado: 10 de febrero de 2014
MSc. Alex Alberto Dueñas Rivadeneira. Máster en Investigación Educativa. Docente Agregado. Universidad Técnica de Manabí, Portoviejo, Manabí. Ecuador. Correo electrónico: alduri81@hotmail.com
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