Validación a microescala del método de ensayo 4-aminoantipirina para cuantificar compuestos fenólicos en cultivos microbianos

Validation to Small Scale of 4-Amineantipirine Assay Methods for Quantification of Phenolic Compound in Mixed Cultures

Lic. Ibrahín Justiz-Mendoza^I, Lic. Isabel Aguilera-Rodríguez^II, MSc. Irasema Pérez-Portuondo^II, Dra. C. Arelis Ábalos-Rodríguez^II, Dra. C. Rosa M. Pérez-Silva<sup>II

I</sup>Unidad Empresarial de Base de Elaboración de la Empresa Cervecera "Hatuey", Santiago de Cuba, Cuba ]]> ^IICentro de Estudios de Biotecnología Industrial. Facultad de Ciencias Naturales, Universidad de Oriente, Santiago de Cuba, Cuba. isabel@cebi.uo.edu.cu; iperez@cebi.uo.edu.cu; aabalos@cebi.uo.edu.cu; rmaria@cebi.uo.edu.cu

RESUMEN

La validación de métodos de ensayos a microescala es, actualmente, de mucha importancia debido a las ventajas económicas y ambientales que posee, lo que constituye una premisa para la realización de servicios y una garantía de la calidad de los resultados para brindar al cliente. El presente trabajo aborda la validación a escala micro del método espectrofotométrico 4-aminoantipirina para la cuantificación de compuestos fenólicos en medio de cultivo, para lo cual se evaluaron los parámetros linealidad, precisión, regresión, exactitud, límites de detección, de cuantificación y robustez; además del ensayo de comparación con un método no estandarizado para determinar polifenoles (Folin Ciocalteu). Los resultados mostraron que ambos métodos son factibles para la determinación de fenoles.

Palabras clave: compuestos fenólicos, validación de métodos analíticos, 4-aminoantipirina, medio de cultivo.

ABSTRACT

The validation of assay methods to small scale constitutes nowadays very important due to the advantages economic and environmental that they possess, that constitutes a premise for the realization of services and a guaranty of the quality of the results to heated bread to client. The present work show the validation to small scale to spectrophotometric method (direct method) of 4-aminoantipirina to determine phenols compound in mixed culture. For the validation were evaluate the parameters linearity, precision, regression, accuracy, detection limits, limit of quantification and robustness. Besides to assay comparison whit the no standardized method to determine poly-phenols (Folin Ciocalteu), the results evidenced that both methods are feasible for the determination of phenols.

Keywords: phenolic compound, validation of analytic methods, 4-amineantipirine, mixed culture.

INTRODUCCIÓN

Los fenoles y sus derivados clorados son contaminantes tóxicos que se presentan en varios efluentes industriales como resultado de la fabricación de pulpa de papel, preservación de madera, fabricación y utilización de insecticidas, manufactura de plásticos, pinturas, colorantes, desinfectantes, residuos de refinerías, entre otros. Esta contaminación constituye un problema, sobre todo si el destino final de los desechos obtenidos es vertido a cuerpos receptores de interés sin un tratamiento previo adecuado antes de su descarga^{1, 2}. Su aparición en múltiples ambientes y su peligrosidad hacen necesario el establecimiento de técnicas analíticas sencillas y fiables que permitan, de manera rápida, su control y monitoreo.

Muchos microorganismos son capaces de metabolizar completamente o mineralizar estos contaminantes orgánicos medioambientales, los que pueden ser degradados bajo condiciones aerobias y/o anaerobias³. Destacan los géneros Bacillus y Pseudomonas por su demostrada habilidad para degradar estos compuestos de manera eficaz^{4, 5}.

Para la cuantificación de la degradación de compuestos fenólicos pueden emplearse varios métodos analíticos, cuya selección depende de la matriz para analizar; entre estos se encuentran las técnicas colorimétricas Folin Ciocalteau, descritas fundamentalmente para muestras de fármacos^{6, 7}, el método Folin Denis⁸ y el método de la 4-aminoantipirina, definido para el estudio de muestras de aguas y aguas residuales, por medio de extracción con cloroformo (método directo) o por medio del método indirecto⁹. Además puede ser determinado por técnicas cromatográficas como la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)¹⁰ y la cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas (LC-MS)¹¹, las cuales son utilizadas, también, para la caracterización estructural de estos compuestos.

El método 4-aminoantipirina, es el establecido como método estándar para la cuantificación de fenoles totales en muestras ambientales; se caracteriza como un método rápido y sencillo, ya que no requiere de instrumental sofisticado¹⁰. Su validación conducirá a la obtención de resultados precisos y exactos, con un alto grado de seguridad dentro de las especificaciones y atributos de calidad previamente establecidos.

La química a microescala ha demostrado su gran utilidad en la práctica experimental de la química general y sintética tanto orgánica como inorgánica, en cambio, en la química analítica no ha sido desarrollada al mismo ritmo, ya que la instrumentación para el trabajo analítico con cantidades de muestras pequeñas y adecuada exactitud y precisión tiene, por lo general, altos costos de adquisición y mantenimiento, cuestión que limita su uso en la investigación formal; no obstante, dadas las ventajas que deriva el trabajo a escala micro, en ocasiones es ventajoso su uso, fundamentalmente cuando se trabaja con reactivos altamente tóxicos y de elevado costo económico^{12, 13}. Por tanto, la certificación de laboratorios competentes no tiene funcionalidad con procedimientos analíticos no validados, siendo un prerrequisito para los laboratorios trabajar en la validación interna de métodos, según lo establecido en las normativas vigentes¹⁴.

El ofrecer servicios competitivos y fiables, teniendo en cuenta el creciente aumento de las investigaciones relacionadas con el medio ambiente por las universidades y organizaciones gubernamentales, es un objetivo central.

El presente trabajo tiene como propósito validar, por verificación, el método de ensayo espectrofotométrico de la 4-aminoantipirina a micro escala, para determinar fenoles y sus derivados en muestras de cultivos microbianos, previo y luego del tratamiento biotecnológico para su depuración.

Equipos y materiales

Las determinaciones fueron realizadas utilizando equipos y cristalería calibrada y validada por la Oficina Territorial de Normalización (OTN). Los reactivos utilizados fueron de calidad apropiada para los ensayos realizados.

Las determinaciones se realizaron en un espectrofotómetro Spectroquant Pharo 300 Merck UV-visible a 500 nm con celda de vidrio con paso de luz de 1,0 cm.

Reactivo 4-aminoantipirina

El reactivo 4-aminoantipirina se preparó en el momento de realizar el análisis. Durante su empleo se conservó en frasco ámbar y protegido de la luz⁸.

Método 4-aminoantipirina

El método de la 4-aminoantipirina seleccionado para la cuantificación de fenol fue el indirecto, según se reporta en el Estándar Methods, pero a un volumen de 5 mL. Para ello, las muestras y patrones fueron ajustados a 7,9 ± 0,1 unidades de pH, a las cuales se hace reaccionar con la 4-aminoantipirina en presencia de ferricianuro de potasio, formando un compuesto antipirina coloreado que es mantenido en solución acuosa.

El ensayo se realizó según procedimiento descrito por APHA (2012)⁸. Se tomaron 125 µL de hidróxido de amonio y se añadieron a tubo de ensayo con 2,5 mL, de muestra y blanco, posteriormente se adicionó solución de tampón fosfato hasta lograr pH de 7,90 ± 0,1 unidades, luego se adicionaron 50 µL de reactivo 4-aminoantipirina al 2 % y 50 µL de reactivo ferrocianuro de potasio al 8 %; se homogeneizó la mezcla y se esperó aproximadamente 15 min.Transcurrido el tiempo de reacción, se realizó la lectura en espectrofotómetro a 500 nm contra blanco de reactivos.

La determinación de la concentración se evaluó mediante curva de calibración. Para ello se utilizó una solución patrón del fenol a 1 mg · mL^-1, a partir de la cual se prepararon patrones de 1-5 µg · mL-1, los cuales recibieron el mismo tratamiento que las muestras.

Metodología para la validación del método analítico 4-aminoantipirina

Linealidad: Se construyó una curva de calibración y para ello se prepararon soluciones tomando de la solución patrón, alícuotas correspondientes a 500, 1 000, 1 500, 2 000, 2 500 µL, realizando el mismo tratamiento para n = 10 de un patrón de referencia de fenol. Se determinó el coeficiente de variación del factor respuesta; se realizó un análisis de varianza en todos los niveles de concentración estudiados, así como el análisis de regresión simple entre las variables cantidad recuperada contra cantidad añadida. Además se calcularon los porcentajes de recuperación en cada nivel de concentración.

Precisión: Se realizó por determinación de la desviación estándar y coeficiente de variación (CV) de los resultados del análisis de muestras sintéticas para n = 10 a 5 niveles de concentración en condiciones de repetitividad.

Exactitud o veracidad: Para determinar el grado de exactitud de un método analítico existen varias pruebas según la disponibilidad o no de un material o método de referencia. Cuando no se dispone de materiales de referencia, debe determinarse el porcentaje de recuperación¹⁵.

Para esto, se tomó la muestra determinando la concentración inicial de fenol previo al análisis de adición de estándar, posteriormente se adicionó una cantidad conocida de fenol en correspondencia con la cantidad de fenol presente en la muestra. El porcentaje de recuperación del analito añadido se calculó como cien veces la diferencia entre las medias de las series dividida entre la cantidad de analito añadida:

donde: C.A = cantidad ensayada (muestra con analito añadido); S.A = cantidad original en la muestra (sin analito añadido) y A = cantidad de analito añadido.

Para determinar el porcentaje de recuperación, se realizaron cinco determinaciones en muestras patrón, añadiendo 1,1; 2,1 y 3,1 de analito.

Robustez: Se realizó un diseño factorial 2². Para esto se tomaron factores que pueden influir en el resultado final del método de análisis, en este caso se evaluaron cantidad del buffer a añadir y cantidad del reactivo 4-aminoantipirina. Se realizaron cuatro determinaciones.

Límite de detección: Se realizaron determinaciones del blanco en muestras blanco para n = 20.

Determinación de fenoles por el método Folin-Ciocalteu

Para la cuantificación de fenoles en las muestras estudiadas se empleó el método de Folin Ciocalteu como método de comparación no normalizado, la cual se llevó a cabo según lo descrito por Rodríguez y col. (2011)¹⁵.

Procesamiento estadístico

Se realizaron pruebas de hipótesis, para comparación de muestras, y pruebas de Fisher para la comparación de varianzas; además de pruebas de regresión y correlación. Para lo cual, se empleó el programa computacional STARGRAPHIC TM.

La presencia de especies químicas tóxicas en las muestras medioambientales da lugar a serios problemas cuya solución compete a la Química Analítica del Medio Ambiente, puesto que la toxicidad de una especie química está determinada por su concentración y por su forma química, cuestión que puede dar origen a dos problemas de importancia inmediata: la determinación de la concentración total y/o de la forma química de las especies tóxicas en las muestras medio ambientales y el control de la contaminación, es decir la disminución de la concentración de especies tóxicas hasta niveles tolerables para la salud.

Ejemplo de lo anterior es la presencia de fenol y sus derivados en aguas y aguas residuales producto de la actividad antropogénica, las cuales pueden ser tratadas por vía biotecnológica para minimizar y/o eliminar su impacto al ambiente. Por tanto, para su estudio es necesario contar con métodos analíticos rápidos y fiables, de bajo costo y amigables del ambiente. Como garantía, deben ser validados siguiendo los requerimientos establecidos por la normas actuales¹⁶, los cuales son más factibles si se logra su validación a escala micro, por las ventajas que refiere al medioambiente, dado por un menor costo de operación, menor espacio de almacenamiento, menor cantidad de desechos, menor riesgo de operación y, por tanto, menor gasto de agua, disolventes y reactivos químicos.

Seguidamente se valora la validación del método espectrofotométrico 4-aminoantipirina, estandarizado a escala convencional, pero en el presente estudio se evalúa a escala micro.

Linealidad

La linealidad del método se determinó por la recta de mejor ajuste, por medio del análisis de regresión de los mínimos cuadrados. La figura 1 representa la curva de calibración a través de la cual se determina la linealidad del método al aplicar la regresión lineal para n = 10 que dio origen a la recta de mejor ajuste. Se ensayaron muestras de concentraciones desde 1-5 µg · mL^-1.

Los resultados reflejan un coeficiente de correlación y de regresión lineal por encima de los límites establecidos (r ³ 0,998 9 y r2 ³ 0,997 8) cuestión que indica una alta correspondencia entre la concentración y la respuesta analítica para las diez determinaciones realizadas, con 99 % de confiabilidad.

El estadístico r² (coeficiente de determinación) indica que el modelo ajustado explica el 99,89 % de la variabilidad observada, y el coeficiente de correlación con un valor de 0,997 8, demuestra que existe una dependencia lineal entre la concentración y la señal analítica en el intervalo evaluado.

La linealidad del método es corroborada por el gráfico de los residuos (diferencia entre los valores experimentales y los predichos por el modelo ajustado) en función de la concentración (figura 2). La figura revela que los puntos están distribuidos al azar alrededor del eje X, indicando que la curva es realmente lineal hasta los 5 µg · mL^-1 de fenol, valor que está en correspondencia con lo reportado en otros trabajos^{18, 19}, en los que se describe un comportamiento de linealidad hasta los 8 µg · mL^-1.

La tabla 1 muestra el análisis de varianza (Anova) del modelo de regresión; se observa que el Fcalculado = 207,72 y el Ftabulado (P= 0,05) = 4,7E^-3 por lo que Fcalculado > Ftabulado, lo que demuestra que existe una buena correlación entre la absorbancia y la concentración, lo que permite evaluar la concentración de fenol por los valores de la absorbancia obtenidos.

Precisión y exactitud

La precisión de un método solo depende de la distribución de los errores aleatorios, que no está asociada con el valor verdadero y se expresa generalmente como la desviación típica del resultado analítico. Tiene como objetivo conocer la variabilidad y los factores susceptibles de influir sobre los resultados de un ensayo, los que no pueden ser siempre controlados (analista, equipo, instrumental, reactivos, tiempo, etcétera)¹⁶.

En este estudio, la precisión fue determinada a través de la repetibilidad, evaluando la variabilidad del método operado para el análisis a escala micro sobre la muestra, en las mismas condiciones de ensayo (analista, equipo y reactivos) y laboratorio. La determinación fue realizada a través de la desviación típica relativa (CV) para cinco niveles de concentración, que abarcaron el intervalo de concentración en que se encuentran las muestras a partir de una solución Stock de fenol (1 mg · mL^-1) y en condiciones de repetitividad (tabla 2).

El coeficiente de variación obtenido para los cinco niveles de concentración evaluados fue de 0,02, mucho menor que lo permitido como límite para métodos espectrofotométricos (< 3 %), lo que evidencia que el método estandarizado a escala micro es preciso para las concentraciones establecidas en las condiciones de trabajo ensayadas.

La exactitud indica que los resultados que se obtienen con un método analítico están próximos al valor verdadero o al que se acepta convencionalmente como valor verdadero. Para determinar si el método es exacto se realizó la prueba de recuperación a tres muestras con concentraciones iniciales de 1,06; 2,07 y 3,08 µg · mL^-1, a las cuales se les añadió una cantidad conocida del analito (tabla 3).

Los porcentajes de recuperación obtenidos, oscilan entre 99,1 y 100,9 %, sugiriendo que el método tiene buena exactitud. Para comprobar que la recuperación es satisfactoria se realizó una prueba-t, donde se comparó la media de recobrado obtenida con respecto al 100 % (recobrado teórico). Debido a que el p-valor para esta prueba es mayor o igual a 0,05 (p = 0,064 1), no se rechaza la hipótesis nula, con un nivel de confianza del 95,0 % y, por tanto, se concluye que el porcentaje de recuperación obtenido (100,01) representa el 100 % de recuperación.

La veracidad del método fue evaluada para cada concentración estudiada con un tamaño de muestra de n = 10 (tabla 3).

El límite de detección (LD) ha sido definido como la menor cantidad de analito detectable, pero no cuantificable por el método de análisis en una muestra, mientras que el límite de cuantificación o de determinación (LC) es el valor mínimo de analito cuantificable por el método en una muestra¹⁰.

Para determinar los límites de cuantificación y de detección del método espectrofotométrico 4-aminoantipirina, se realizó la determinación de veinte muestras blanco de agua destilada. Los resultados se muestran en la tabla 4.

El límite de detección calculado fue de 0,052 µg · mL^-1 y el límite de cuantificación fue 0,62 µg · mL^-1. Ambos resultados confirman la utilidad del método para cuantificar pequeñas cantidades de fenoles en medio de cultivo.

Robustez

La robustez se define como la medida de la capacidad que posee un método analítico para permanecer inalterado ante pequeñas, pero deliberadas variaciones en ciertos parámetros; es decir, capacidad que demuestra el procedimiento de análisis para proporcionar resultados válidos en presencia de pequeños cambios respecto a las condiciones descritas en el método, susceptibles de producirse durante su utilización¹⁴, lo que proporciona idea de su fiabilidad o "estabilidad" durante su empleo en análisis de rutina.

Dado que el método de la 4-aminoantipirina se fundamenta en una reacción, donde el ajuste de pH es fundamental para garantizar la formación del complejo coloreado entre el reactivo 4-aminoantipirina y el fenol presente en la muestra, condiciones significativas para la obtención de un buen resultado analítico; se comprobó la robustez del método por medio de un diseño factorial 2², donde se evaluaron los factores volumen de buffer añadido y cantidad de reactivo, como factores dependientes para el método ensayado, cuya variable de respuesta fue la concentración de fenoles totales.

Con los resultados del análisis ANOVA (tabla 5), se pudo comprobar que ninguno de los factores estudiados, ni la combinación de estos, influye significativamente en los resultados analíticos del método (p-valor > 0,05) con un nivel de confianza del 95 %, lo que demuestra que el método de la 4-aminoantipirina es robusto frente a los factores estudiados.

También el método se ha empleado con varias modificaciones en cuanto a concentración del reactivo precursor (4-aminoantipirina)²⁰.

Comparación del micrométodo 4-aminoantipirina con el Folin Ciocalteu

La determinación de compuestos fenólicos en muestras de aguas puede ser cuantificado mediante varias variantes (3) descritas en la literatura. En este trabajo se evalúan dos que resultan similares para la determinación de fenoles totales.

Si bien el método de la 4-aminoantipirina (método 1), es el conocido como método espectrofotométrico estándar para la cuantificación de fenoles en muestras de aguas y aguas residuales, se procedió a la comparación con el método establecido para la cuantificación de compuestos fenólicos en extractos de plantas por el método de Folin Ciocalteu (método 2) ya estandarizado por Rodríguez y col. (2011), teniendo en cuenta que en el método estudiado, de escala convencional fue ajustado a microescala en cuanto a tamaño de muestra y reactivos utilizados. Los resultados obtenidos se muestran en la tabla 6.

El análisis estadístico realizado refleja que no existen diferencias significativas entre los valores alcanzados en ambos métodos de cuantificación, lo que evidencia que ambos pueden determinar el contenido de fenoles en muestras ambientales.

Determinación de compuestos fenólicos en muestras de medio de cultivo

Los compuestos fenólicos son tóxicos para la mayoría de los microorganismos en concentraciones superiores a los 80 µg · mL^-1, de ahí que se considere un éxito encontrar bacterias que degraden completamente concentraciones cercanas a estas. Lo anterior justifica la búsqueda de bacterias degradadoras de estos compuestos y su ensayo en concentraciones entre los 100 y 300 µg · mL^{-1 19-22}. Por tanto, para el estudio se debe contar con métodos precisos que permitan de manera rápida y sencilla el monitoreo del proceso de degradación.

Partiendo de lo anterior, para la evaluación de la efectividad del método 4-aminoantipirina a escala micro, se procedió a cuantificar los fenoles en muestras incubadas en medio mineral salino con 80,8 µg · mL^-1 de 2-clorofenol e inoculada con cultivo de cepa RS-11 y RS-13.

La tabla 7 muestra los valores de concentración antes y después del proceso de degradación, cuantificado a través del método evaluado. La cuantificación fue realizada mediante evaluación de muestras de cultivo en tiempo cero y transcurridas 48 h de experimentación.

Pasadas 48 h la concentración del 2-clorofenol descendió a 40 y 30 % para RS-11 y RS-13, respectivamente. Ello demuestra que las cepas no adaptadas a un compuesto tóxico necesitan más tiempo para que su maquinaria enzimática degrade el compuesto orgánico evaluado, minimizando así su toxicidad o utilizándolo como fuente de carbono. Resultados similares obtuvo Magdolna (2013) cuando observó que a medida que aumentaba la concentración de 4-CF (10, 100 y 1 000 µg · mL^-1) disminuía el porcentaje de degradación (88, 50 y 15 %, respectivamente), durante un tiempo de incubación de 164 h ^{23, 24}.

El coeficiente de variación de las determinaciones fue de 0,004 1 y 0,003 8 % para los cultivos con RS-11 y RS-13, respectivamente; lo que demuestra que el método es efectivo para la cuantificación de fenoles totales en cultivos bacterianos, los cuales requieren de técnicas precisas y poco volumen de muestra.

Los resultados del estudio de la validación por verificación a microescla del método de la 4-aminoantipirina para la determinación de fenoles totales en muestras de cultivo microbiano indican que el mismo es adecuado y proporciona datos confiables para ser utilizado como análisis de rutina en la cuantificación de estas moléculas, con menor gasto de reactivos y por tanto mínima generación de residuos, lo que proporciona ventajas económicas y medioambientales.

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Ibrahín Justiz-Mendoza, Unidad Empresarial de Base de Elaboración de la Empresa Cervecera "Hatuey", Santiago de Cuba, Cuba