Caracterización de la fragilidad osmótica de eritrocitos humanos en la anemia drepanocítica
Characterization of osmotic fragility of human erythrocytes in chronic haemolytic anemia
MSc. Yamirka Alonso-Geli, MSc. Yamisleydi Alonso-Moreno, Lic. José E. Falcón-Diéguez, Est. Liset Lucambio-Miró, Est. Mariana Castro-Piñol
Centro de Biofísica Médica, Santiago de Cuba, Cuba, yamirka.alonso@cbiomed.cu, yamisleydi@inor.sld.cu, jfalcond05@yahoo.com
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RESUMEN
Como la anemia drepanocítica se caracteriza por una anemia hemolítica crónica, fue evaluada la fragilidad osmótica de eritrocitos normales y drepanocíticos. Se trabajó con sangre de individuos sanos y pacientes drepanocíticos. Se realizó la prueba de fragilidad osmótica inmediata. Los resultados muestran que la resistencia globular mínima fue al 0,45 % de NaCl y la resistencia globular máxima al 0,32 % de NaCl. En eritrocitos drepanocíticos la resistencia globular mínima fue al 0,36 % de NaCl y la resistencia globular máxima al 0,1 % de NaCl. Al comparar los resultados para cada tipo de célula se observó disminución de la fragilidad osmótica en eritrocitos drepanocíticos respecto a los normales, evidenciada por el desplazamiento de la curva hacia valores de NaCl inferiores. Se encontraron diferencias significativas entre las medias de los porcentajes de hemólisis en las soluciones entre 0,1 % y 0,36 % de NaCl (p < 0,05).
Palabras clave: fragilidad osmótica, eritrocitos, drepanocitos, anemia drepanocítica.
ABSTRACT
Since sickle cell diseases are characterized by chronic hemolyticanemia, this work aims to characterize the osmotic fragility of normal and sickled erythrocytes. We worked with blood samples of healthy individuals and sickle cell patients. We carry out the rapid osmotic fragility test. The results show that the minimum globular resistance was at 0,45 % NaCl and the maximum resistance was at 0,32 % NaCl. In sickle cell, resistance was at 0,36 % NaCl and the maximum globular resistance was at 0,1 % NaCl. By comparing the results for each type of cell, we obtain decrease of osmotic fragility of the sickle cells against normal cells, showing a shift of the curve towards lower values of % NaCl. We found statistically significant differences between the means of the percentage of hemolysis in hypotonic solutions between 0,1 % and 0,36 % NaCl (p < 0,05).
Keywords: osmotic fragility, erytrhocytes, sickle cells, sickle cell anemia.
INTRODUCCIÓN
]]> La anemia drepanocítica (AD), es una anemia hemolítica congénita de causa intracorpuscular, caracterizada por la presencia de una hemoglobina mutada denominada hemoglobina S; este se transmite con carácter autosómico recesivo [1]. La hemoglobina mutante presenta un cambio de aminoácidos en su estructura proteica, por lo que tiende a ser muy poco soluble a bajos niveles de oxígeno, lo que conlleva a que polimeriza en el interior del eritrocito desoxigenado para dar lugar a la falciformación del mismo; se observan en la sangre numerosos eritrocitos en forma de hoz o drepanocitos más rígidos y menos flexibles que los de un individuo normal [2]. Se considera un problema de salud pública en nuestro país por su alta incidencia, morbilidad y mortalidad; a fecta al 3,1 % de la población cubana distribuida fundamentalmente en Ciudad de La Habana, Santiago de Cuba y Guantánamo [3]. La enfermedad evoluciona con dolores reumatoides, osteoarticulares, úlceras en las piernas y crisis hemolíticas.Como se caracteriza por una anemia hemolítica crónica, es importante evaluar la hemólisis en diferentes condiciones, mediante la prueba de fragilidad osmótica [4], que se basa en la medición de la hemólisis de los eritrocitos en condiciones de estrés osmótico [5], y permite evaluar las propiedades de las membranas citoplasmáticas y el efecto en el volumen intracelular [6].
La osmosis es la difusión de agua de un medio con menor concentración de solutos hacia medios con mayor concentración de solutos a través de una membrana semipermeable [7], para lograr un equilibrio de concentraciones a ambos lados de la membrana. La prueba de fragilidad osmótica es muy útil para el diagnóstico diferencial de anemias hemolíticas hereditarias caracterizadas por la destrucción acelerada de los eritrocitos [8].
Muestras biológicas
En el estudio se empleó sangre periférica obtenida por venipunción de individuos supuestamente sanos y pacientes drepanocíticos del servicio de hematología del Hospital "Juan Bruno Sayas" de Santiago de Cuba, previa información a los mismos.
Preparación de las muestras
La sangre total heparinizada se centrifugó a 2 500 rpm durante 10 min; se desechó el plasma, y el concentrado de eritrocitos se lavó tres veces con buffer fosfato salino (PBS) pH 7,4, 1 M. Se preparó una suspensión de eritrocitos al 25 % con el mismo buffer.
A 5 mL de cada solución (a las diferentes concentraciones de NaCl) se le añade 100 µL de la suspensión de eritrocitos al 25 %, se homogeniza la mezcla invirtiendo los tubos suavemente, se deja reposar durante 30 min a temperatura ambiente. Luego, se centrifuga a 2 500 rpm durante 5 min, y se desecha el precipitado.
Luego se procede a graficar los datos correspondientes (figura 1).
Análisis estadístico
El procesamiento estadístico de los datos se realizó mediante el análisis de varianza (ANOVA). Se efectuó la prueba de Kolmogorov-Smirnov y la comparación múltiple de medias por el método de Tukey-Kramer, empleando el paquete SPSS 11. Los valores mostrados representan el valor medio de cinco determinaciones. Se consideraron significativas las diferencias a p < 0,05.
La prueba de fragilidad osmótica indica la resistencia de los eritrocitos a la ruptura por acción de la presión osmótica, ejercida sobre la membrana eritrocitaria, al colocarlos en soluciones salinas hipotónicas; es un indicador de la razón volumen/superficie celular, importante para el diagnóstico diferenciado y la evolución de determinados tratamientos.
TABLA 1. PORCENTAJE DE HEMÓLISIS DE ERITROCITOS
NORMALES EN PRESENCIA DE SOLUCIONES HIPOTÓNICAS
DE NaCl A DIFERENTES CONCENTRACIONES
| % NaCl | % Hemólisis | Desviación estandar |
| 0 | 100 | ]]> 0 |
| 0,1 | 101 | 8 |
| 0,2 | 104 | 10 |
| 0,25 | 104 | 10 |
| ]]> 0,3 | 102 | 7 |
| 0,32 | 94 | 9 |
| 0,36 | 84 | 24 |
| 0,4 | ]]> 72 | 19 |
| 0,45 | 14 | 11 |
| 0,55 | 2 | 3 |
| 0,7 | 1 | ]]> 1 |
| 0,9 | 1 | 1 |
Los resultados muestran que la resistencia globular mínima (comienzo de la hemólisis) fue en soluciones de 0,45 % de NaCl y la resistencia globular máxima (hemólisis completa de los eritrocitos) se produce a 0,32 % de NaCl; estos resultados son consistentes con los descritos por otros autores [5]. En individuos supuestamente sanos y sin alteraciones en la membrana de los eritrocitos, la hemólisis se produce entre 0,45 % y 0,35 % de NaCl [9].
Para la resistencia globular mínima se toma como valor de referencia el 10 % de hemólisis, que representa el valor máximo permisible para considerar la hemólisis dentro de los límites normales. Se toma como valor de referencia para la resistencia globular máxima el 90 % de hemólisis.
Cuando los eritrocitos se colocan en una solución hipotónica, se incrementa el flujo de agua hacia el interior para lograr el equilibrio de concentraciones de solutos entre el interior y el exterior celular, los eritrocitos se hinchan hasta alcanzar el punto crítico, donde la membrana pierde su integridad y ocurre la hemólisis [10].
La habilidad de los eritrocitos normales para resistir la hipotonicidad proviene de su forma bicóncava y las propiedades elásticas de las membranas, las que permiten que la célula aumente su volumen hasta un 70 % antes de que la membrana se estire; una vez superado este límite ocurre la hemólisis [11].
Estudio de fragilidad osmótica en eritrocitos drepanocíticos
]]> Los resultados del estudio de la fragilidad osmótica en eritrocitos drepanocíticos, obtenidos de sangre periférica de pacientes con anemia drepanocítica, se muestran en la tabla 2.TABLA 2. PORCENTAJE DE HEMÓLISIS DE ERITROCITOS
DREPANOCÍTICOS EN PRESENCIA DE SOLUCIONES
HIPOTÓNICAS DE NaCl A DIFERENTES
CONCENTRACIONES
| % NaCl | % Hemólisis | Desviación estandar |
| 0 | ]]> 100 | 0 |
| 0,1 | 102 | 14 |
| 0,2 | 83 | 15 |
| 0,25 | 81 | ]]> 13 |
| 0,3 | 53 | 14 |
| 0,32 | 57 | 18 |
| 0,36 | 11 | 7 |
| ]]> 0,4 | 6 | 5 |
| 0,45 | 3 | 4 |
| 0,55 | 2 | 2 |
| 0,7 | ]]> 2 | 3 |
| 0,9 | 2 | 2 |
Como se observa, la resistencia globular mínima fue en soluciones de 0,36 % de NaCl y la resistencia globular máxima es a 0,1 % de NaCl; estos resultados son similares a los obtenidos por otros autores [5, 12]. Debe tenerse en cuenta que la hemólisis en los pacientes drepanocíticos puede alcanzar valores de hasta el 40 %, por las características propias de la enfermedad [13].
Al comparar los resultados obtenidos en cada tipo de célula (eritrocitos normales y drepanocíticos) se observa una disminución de la fragilidad osmótica en eritrocitos drepanocíticos respecto a los normales, que se evidencia en un desplazamiento de la curva hacia valores de porcentaje de NaCl inferiores, lo que representa mayor resistencia de los mismos a la hemólisis en presencia de soluciones hipotónicas (figura 1). Los valores mostrados en la figura representan el valor medio de cinco determinaciones.
Se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre las medias de los porcentajes de hemólisis en las soluciones hipotónicas entre 0,1 % y 0,36 % de NaCl para un nivel de significación del 95 %.
La fragilidad osmótica de los eritrocitos drepanocíticos se ve disminuida y la fragilidad mecánica in vitro, aumentada. Singer y Fisher comprobaron que los eritrocitos que contienen hemoglobina S son los de menor término de vida cuando se transfunden a sujetos normales y son también los que tienen mayor fragilidad mecánica in vitro [6].
A pesar de que todos los autores concuerdan con el comportamiento fenomenológico de la fragilidad osmótica en eritrocitos drepanocíticos, los mecanismos moleculares que lo originan no han sido completamente dilucidados; una hipótesis que permite un acercamiento a las causas del fenómeno está relacionada con factores facilitadores de la drepanocitosis como el aumento de la concentración corpuscular media de hemoglobina S (CCMH) y la disminución del volumen corpuscular medio (VCM).
]]> El incremento de la CCMH pone de manifiesto un grado extremo de deshidratación celular, que se explica por las alteraciones de polimerización irreversible de la deoxi-Hb S y el efecto que ejerce sobre la membrana eritrocitaria, particularmente en las alteraciones de sus propiedades fisicoquímicas. Al colocar la célula deshidratada en un medio acuoso comienza a entrar agua al interior celular hasta alcanzar el equilibrio de concentraciones; una vez llegado este punto crítico, la célula comienza a hincharse hasta que rebasa la capacidad de elasticidad de la membrana y ocurre la hemólisis por la presión osmótica ejercida sobre la misma.
La fragilidad osmótica de eritrocitos normales es de 0,45 %-0,32 % de NaCl; para eritrocitos drepanocíticos presenta valores de 0,36 %-0,1 % de NaCl.
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Recibido: 15/09/2014
Aceptado: 05/12/2014
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MSc. Yamirka Alonso-Geli, Centro de Biofísica Médica, Santiago de Cuba, Cuba, yamirka.alonso@cbiomed.cu
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