1 Especialista A en Producción de Hemoderivados.
2 Investigador Auxiliar.
3 Investigador Aspirante.
Palabras clave: ULTRAFILTRACION; LIOFILIZACION; POLIMEROS; INMUNOGLOBULINAS.
A partir de la década del 80 esta técnica tomó gran importancia pudiéndose lograr concentraciones terapéu-ticas de inmunoglobulinas al 16 % de concentración a pesar de su alta viscosidad, lo cual fue facilitado por el uso de las membranas planas.2
En el momento actual se utiliza esta tecnología como paso intermedio para eliminar el alcohol y las sales durante el proceso de producción de las inmunoglobulinas intravenosas (IGIV),3,4 dejando la liofilización solamente para la formulación de aquellos productos que no son estables en estado líquido y necesitan para su almacenamiento la forma liofilizada.5-7
La ultrafiltración no sólo elimina el agente precipitante o sales del sistema, sino también puede eliminar otras proteínas con pesos moleculares inferiores al cut-off del módulo utilizado pudiendo concentrar la inmunoglobulina al nivel deseado en la formulación final.
Las preparaciones de inmunoglobulinas son más viscosas que las de la albúmina, lo cual hace más difícil su concentración. Es por ello que se debe tener especial cuidado en la selección en el sistema de ultrafiltración.
El objetivo de este trabajo es demostrar las ventajas de la ultrafiltración sobre la liofilización como etapa intermedia para la eliminación del etanol en la producción de las inmunoglobulinas obtenidas por el método de Cohn,8 analizando también la formación de polímeros por ambos métodos. Dada la alta viscosidad del preparado quisimos comprobar si existían diferencias en cuanto al uso de las membranas planas y la fibra hueca.
En la etapa de ultrafiltración el lote se llevó del volumen inicial restituido hasta un volumen 5 veces menor. El permeado se analizó durante todo el proceso con vistas a detectar fugas de inmunoglobulinas.
La diafiltración se llevó a cabo mediante el intercambio de 5 volúmenes de agua apirogénica por volumen del ultrafiltrado.
Posterior a la diafiltración, el granel obtenido se ajusta en su concentración proteica, para lo cual se siguió el mismo esquema de producción de las inmunoglobulinas en la Planta de Hemoderivados.
El estudio cromatográfico se realizó con la utilización de una columna de Supherose 6 HR (10/30) acoplada a un sistema FPLC.
Tipo de membrana Características Fabricante
Planas - Excelente resistencia a la presión Sartorius
- Alta capacidad de concentración de proteínas
- Pequeños volúmenes muertos ]]>
- Tiempos cortos de ultrafiltraciónFibra hueca - Resistencia moderada a la presión Amicon
- Menor capacidad de concentración de proteínas
- Pequeños volúmenes muertos
- Tiempos largos de ultrafiltración
La tabla 2 presenta los resultados de la ultradiafiltración en 7 lotes de inmunoglobulinas con la utilización del sistema de membranas planas.
No. de lote | ]]> Concentración proteínas de inicial | | | | | | |
| | | ]]> (L) | | | | |
1 | | | | | | | ]]> 11,5 |
2 | | | | | | | |
3 | | | ]]> 15,0 | | | | |
4 | | | | | | ]]> 1,01 | |
5 | | | | | | | |
6 | | ]]> 2,47 | | | | | |
7 | | | | | ]]> 1,2 | | |
_ | | | | | | | |
No. de lote | | | | | | | |
]]> (L) | | | | | | | |
1 | | | | ]]> 100 | | | |
2 | | | | | | | ]]> 2,14 |
_ | | | | | | | |
La tabla 4 demuestra las ventajas de la ultrafiltración sobre la liofilización ya que no se generan polímeros de IgG durante el proceso, mientras que en la liofilización la agregación puede tomar valores de hasta el 4 %.
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| | | |
| ]]> Sartocon | | |
| | | |
| | | ]]> 0 |
| | | |
| | | |
| ]]> Sartocon | | |
| | | |
| | | ]]> 0 |
| | | |
| | | |
| ]]> Liofilización | | |
| | | |
| | | ]]> 1,94 |
Las ventajas de la ultrafiltración sobre otros procesos de separación son:9
- No introduce cambios de fase.
- Bajo costo energético.
- Equipamiento sencillo.
- No se usan sistemas de calentamiento.
- Requiere un mínimo de trabajo.
La liofilización introduce cambios importantes en la molécula de IgG, que pueden ir desde la activación espontánea de la filtración de complemento hasta la producción de quininas biológicamente activas, éstas son productoras del efecto hipotensor en los pacientes que reciben el producto.10,11
La utilización de un cut-off de 100 kd en el sistema de ultrafiltración permite también eliminar contaminantes proteicos de peso molecular menor a esta cifra. Especial importancia posee la eliminación de la ceruloplasmina y la albúmina de este preparado que se confunden con la fracción de monómeros en los productos liofilizados dada su concentración tan baja.12
En los ensayos realizados por ultrafiltración comparados con la liofilización se demuestra un aumento de rendimientos de aproximadamente 1g/L de plasma procesado (Castellano ME, Borrero H, Sánchez L, Cádiz, A. Sustitución de la liofilización por la ultrafiltración en la producción de hemoderivados. VIII Forum de Ciencias y Técnica. La Habana, 1993.) ]]>
Entre los 2 sistemas de ultrafiltración que hemos utilizado existen diferencias que son importantes a la hora de escoger uno u otro para este tipo de producción específicamente (tabla 1). El sistema de membranas planas presenta una excelente resistencia a la presión y es capaz de llegar a altas concentraciones de proteínas (tabla 2). El sistema de fibra hueca resiste menos presión y disminuye su capacidad de ultrafiltración grandemente al aumento de concentración de proteínas (tabla 3).En el caso especial de las inmunoglobulinas, éstas forman una capa coloidal que no incrementa simplemente su concentración en la superficie de la membrana al paso del tiempo, sino que tiende a formar una membrana secundaria conocida como membrana gelatinosa.9
También se encuentran diferencias significativas en el nivel de polímeros entre los productos ultrafiltrados y liofilizados. En las inmunoglobulinas ultrafiltradas no se observan polímeros mientras que con la liofilización se producen alrededor del 2-4 % de éstos (tabla 4).
Existen 2 fenómenos que apoyan estos resultados. Es conocido desde hace muchos años que la presión retarda la desnaturalización de las proteínas aun en presencia de etanol en concentraciones superiores a 0,3 molar,13 y la ultrafiltración trabaja con presiones positivas. Sin embargo, en el proceso de liofilización es necesario aplicar alto vacío y calor. Las pastas de IgG liofilizadas siguen una cinética de desnaturalización que resulta fenomenológicamente de primer orden, la cual se incrementa con la temperatura (Gutiérrez AM. Estudio de la conservación de albúmina y gammaglobulina liofilizadas. Tesis para obtener el título en Master en Ciencias Técnicas. Centro Nacional de Investigaciones Científicas. La Habana, 1995:23-32).
Concluyendo, podemos decir que la ultrafiltración presenta ventajas sobre la liofilización, lográndose productos de mayor calidad. Dada la alta viscosidad que alcanzan las soluciones de inmunoglobulinas incrementada por la baja temperatura de trabajo, es que preferimos los sistemas de membranas planas a los fibra hueca para la ultradiafiltración en este tipo de producción.
Key words: ULTRAFILTRATION; FREEZE-DRYING; POLYMERS; IMMUNOGLOBULINS.