Descriptores DeCS: JUEGO DE REACTIVOS PARA DIAGNOSTICO; HEMOGLOBINA/análisis; CONTROL DE CALIDAD.
La validación de un método analítico es el proceso por el cual queda establecido por estudios experimentales que la capacidad del método satisface los requisitos para la aplicación analítica deseada.1 Ésta se fundamenta en la determinación de diversos parámetros que se aplican de acuerdo con la categoría a la que pertenezcan.2
Para el desarrollo de un nuevo producto es necesario la utilización de métodos analíticos que permitan cuantificar el producto en forma de materia prima o como principio activo de la formulación con un alto grado de confiabilidad.3
En la actualidad los laboratorios de control de la calidad de la Industria Médico-Farmacéutica no sólo se ocupan de analizar si un producto cumple o no con sus requisitos de calidad mediante la utilización de métodos analíticos establecidos para cada uno de ellos, sino también se esfuerzan para validar cada método analítico utilizado en el control de la calidad de sus productos.
Basado en este criterio el laboratorio de control químico inició la validación de sus métodos analíticos con la que interviene en el control de la calidad de un juego de reactivos que se encuentra en fase de desarrollo, y posteriormente será sometido a un estudio de estabilidad.
En este trabajo se muestran los resultados obtenidos en la validación de las técnicas utilizadas en el control de la calidad del juego de reactivos para la determinación de hemoglobina en sangre, compuesto por reactivo 1 (solución de cianuro de potasio 1g/100 mL) y reactivo 2 (tabletas de ferricianuro de potasio 200 mg/tab),4 así como los resultados de la validación del método de análisis de la cianometaglobulina utilizado en el ensayo funcional del juego de reactivos.5
Para garantizar la confiabilidad de los resultados se aseguró el cumplimiento de los requisitos siguientes:6
Para validar las técnicas analíticas utilizadas para la evaluación de la concentración del principio activo en la solución de cianuro de potasio 1 % y en las tabletas de ferricianuro de potasio,4 y de la técnica utilizada para el análisis de la cianometahemoglobina en el ensayo funcional del juego de reactivos,5 se escogieron los parámetros adecuados según los criterios de validación que aparecen reportados en el Procedimiento Normativo Operacional 3.09.001.96 de la Empresa de Productos Biológicos " Carlos J Finlay".
Validación de métodos volumétricos
Los métodos de valoración del cianuro de potasio y el ferricianuro de potasio, fueron validados mediante la evaluación de los parámetros siguientes:
Para el método del cianuro de potasio se preparó un patrón de analito al 100 % de concentración (1g/100 mL) y una solución placebo a la cual se añadió la cantidad necesaria de analito para obtener la concentración al 100 %; ambas soluciones se valoraron utilizando el mismo método analítico. Se determinó la F de Fisher y la t de Student para p = 0,05.
El método de la cianometahemoglobina utilizado en el ensayo funcional del juego de reactivos para determinación de hemoglobina en sangre, se validó de acuerdo con los criterios establecidos según bibliografía consultada.7
Los parámetros son los siguientes:
Parámetro | Procesamiento estadístico | Valoración del cianuro de potasio | Valoración del ferricianuro de potasio | Criterios de aceptación |
Linealidad | . Coeficientes de correlación y determinación | r2 = 0,9989 | r2 = 0,9925 | r2 ³ ,98 |
r = 0,9994 | r = 0,9962 | r £ 0,99 | ||
. Test de linealidad | CVf = 0,63 % | CVf = 1,89 % | CVf £ 5 % | |
Sbrel = 0,84 % | Sbrel = 1,98 % | Sbrel £ 2 % | ||
texp = 118,50 | texp = 46,05 | texp ³ t(16; 0,01) =2,92 | ||
Fexp = 14092,62 | Fexp = 2120,78 | Fexp ³ F(1; 16; 0,01) = 8,53 | ||
FAexp = 2,64 | FAexp = 4,17 | FAexp ³FA(4; 12; 0,01) = 5,41 | ||
. Test de proporcionalidad | a = -0,15 | a = -0,18 | a » 0 | |
IC(a) = (-0,32; 0,10) | IC(a) = (-0,17; 0,29) | IC(a) incluye el 0 | ||
texp = 1,95 | texp = 1,27 | texp < t(16; 0,05) = 2,12 | ||
Precisión | . Coeficientes de | CVrepet=0,40 % | CVRepet = 0,28 % | CVRepet £ 3 % |
Reproducibilidad | . Repetibilidad y variación | CVReprod = 1,83 % | CVReprod = 1,60 % | CVReprod £ 3 % |
CVReprod < 2 CVRepet | ||||
. Test de Anova de clasificación simple | Diferencias no significativas | Diferencias no significativas | Diferencias no significativas | |
Fexp =1,43 | Fexp = 1,31 | Fexp < F(9; 70; 0,01) = 2,82 | ||
. Robustez | . Factorización | Diferencias no significativas para cada factor | Diferencias no significativas para cada factor | Diferencias no significativas |
Exactitud | . Test de Fisher | Fexp = 1,35 | Fexp < F(9; 9; 0,05) = 3,18 | |
. Test de Student | texp = 0,51 | texp < t(18; 0,05) = 2,10 | ||
. Test de Cochran | Gexp = 0,30 | Gexp < G(3; 3; 0,05) = 0,87 | ||
. Test de Student | texp = 0,13 | texp < t(8; 0,05) = 2,30 | ||
Especificidad | | No significativa | No hay respuesta | Respuesta no significativa |
En la tabla 2 se observan los valores obtenidos para el ensayo funcional del juego de reactivos desarrollado, considerando para su evaluación los parámetros de linealidad, precisión a concentraciones bajas, medias y altas del analito (como se recomienda en la bibliografía consultada); además de exactitud y sensibilidad del método, los cuales se encuentran dentro de los rangos de aceptación establecidos. ]]>
Parámetro | Procesamiento estadístico | Resultados | Criterios de aceptación | ||
Sistema instrumental | Método | r2 ³ 0,98 | |||
Linealidad | Coeficientes de correlación y determinación | r2 = 0,9990 | r2=0,9997 | r³ 0,99 | |
r = 0,9995 | r = 0,9998 | ||||
Test de linea lidad | CVf = 0,61 % | CVf = 0,45 % | CVf £ 5 % | ||
Sbrel = 0,25 % | Sbrel = 0,41 % | Sbrel £ 2 % | |||
texp = 399,86 | texp = 242,64 | texp ³ t(16; 0,01) = 2,92 | |||
Fexp = 159887,55 | Fexp = 58876,97 | Fexp³ F(1;16; 0,01) = 8,53 | |||
FAexp = 3,68 | FAexp = 4,98 | FAexp£ FA(4;12; 0,01) = 5,41 | |||
Test de proporcionalidad | | a = 0,15 | a » 0 | ||
IC(a) = (-0,20; 0,50) | IC(a) incluye el 0 | ||||
texp = 0,009 | texp < t(16; 0,05) = 2,12 | ||||
Precisión | Conc. bajas | Conc. medias | Conc. Altas | ||
Repetibilidad y Reproducibilidad | Coeficientes de variación | CVRepet = 0,43 % | 0,16 % | 0,14 % | CVRepet£ 3 % |
CVReprod = 0,11 % | 0,22 % | 0,02 % | CVReprod £ 3 % | ||
CVReprod < 2 CVRepet | |||||
Test de Anova de clasificación simple | Diferencias no significativas | Diferencias no significativas | |||
Fexp = 0,31 | 1,21 | 0,68 | Fexp < F(9; 70; 0,01) = 2,82 | ||
Robustez | Factorización | Diferencias no significativas | Diferencias no significativas para cada factor | ||
Exactitud | Análisis de regresión lineal | r2 = 0,9960 | r2 >0, 98 | ||
Fexp = 8856,66 | Fexp > F(1;98;0,01) = 6,85 | ||||
IC(b) = (0,96; 1,01) | IC(b) incluye el 1 | ||||
IC(a) = (-0,09; 0,43) | IC(a) incluye el 0 | ||||
b = 0,9859 | b » 1 | ||||
Sensibilidad | Coeficiente de variación | a = 0,15 | 3½a½ LD = ----- b | ||
b = 2,88 | |||||
LD = 0,16 g/dL | CV = 0,52 % | CV £ 3 % | |||
LC = 0,52 g/dL | CV = 0,62 % | 10½a½ LC = ----- b | |||
Para confirmar que dicha regresión era lineal se aplicaron diferentes test de linealidad, considerando el análisis de la varianza (FAexp) el tests más riguroso que corroboró la linealidad de los métodos y del sistema instrumental. De igual forma se comprobó que se cumple la condición de proporcionalidad y el error sistemático de cada método es despreciable.
Por otra parte, el estudio de precisión mostró una buena repetibilidad y reproducibilidad de los resultados de acuerdo con los criterios de aceptación, mientras que los factores estudiados para cada método en el ensayo de robustez no influyeron significativamente en los resultados, por lo cual podemos considerar que dichos métodos son precisos.
Para evaluar la exactitud se aplicaron diferentes procedimientos experimentales y estadísticos que responden a las características propias del método analítico validado. En el caso del método de valoración del ferricianuro de potasio se comprobó que el rango de concentraciones estudiado no influye en la variabilidad de los resultados, ya que se cumplió con el criterio del test de Cochran (Gexp), además no se obtuvieron diferencias significativas entre la recuperación media y el 100 % al aplicar el test de Student (texp), confirmando la buena exactitud del método. ]]>
Se determinó igualmente que el método de valoración del cianuro de potasio es exacto, ya que no existen diferencias significativas entre los resultados, ni por su varianza (test de Fisher) ni por la diferencia de medias (test de Student); mientras que para el método de determinación de la cianometahemoglobina se obtuvo un 98 % de equivalencia con el método de referencia de la firma comercial Wiener y una recta de regresión lineal: y=0,9859 x + 0,1754, que garantiza la exactitud del método.Además, se comprobó que ambos métodos volumétricos son específicos, ya que los productos de degradación en un caso no interfieren en la valoración, mientras que en el otro la respuesta es insignificante.
Los límites de detección (LD) y cuantificación (LC) calculados para el método de determinación de la cianometahemoglobina, fueron corroborados experimentalmente. El método es sensible, ya que no se encontraron diferencias significativas entre los resultados obtenidos para cada límite y los coeficientes de variación para cada uno de ellos fueron menores que el coeficiente de variación permitido para el método.
Todos los resultados obtenidos en la validación de los métodos volumétricos y espectrofotométrico permiten asegurar que son confiables, ya que cumplen los criterios de validación reportados por Castro y otros en 1989 y por Aguilar y otros en 1992. Además ambos métodos pueden ser utilizados tanto en el control de la calidad como en el estudio del juego de reactivos para determinación de hemoglobina en sangre.
De esta manera se comprobó experimentalmente la utilidad del procedimiento establecido para la validación de métodos analíticos; y queda abierto el camino a la validación de todos los métodos analíticos en el control de la calidad.
Subject headings: REAGENT KITS, DIAGNOSTIC; HEMOGLOBINS/analysis; QUALITY CONTROL.
Lic. Miriam Díaz de Armas. Empresa de Productos Biológicos "Carlos J. Finlay". Infanta No. 1162, municipio Centro Habana, Ciudad de La Habana, Cuba.
1 Master en Ciencias. Licenciada en Farmacia. Investigadora Agregada.
2 Licenciada en Farmacia. Aspirante a Investigadora.
3 Licenciada en Química. Investigadora Agregrada.
4 Licenciada en Química. Aspirante a Investigadora. ]]>