Descriptores DeCS: CITOMETRIA DE FLUJO; TECNICAS Y PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO; INFECCIONES POR VIH.
Los leucocitos presentan una gran cantidad de moléculas marcadoras en su superficie, algunas de las cuales aparecen momentáneamente en etapas particulares de la diferenciación o de la activación celular. Las proteínas marcadoras de membrana se pueden usar para distinguir las diferentes poblacionales celulares, y muchas de ellas se pueden identificar por medio de anticuerpos monoclonales (AcMs) específicos.1,2 El desarrollo de estos anticuerpos, conjugados con diferentes fluorocromos, que se pueden usar en análisis por medio de citometría de flujo, ha revolucionado y propiciado grandes avances en el análisis de diferentes subpoblaciones de linfocitos. Así, la citometría de flujo ha emergido como una herramienta importante y poderosa en la diferenciación de subpoblaciones celulares.3
El análisis de las subpoblaciones de linfocitos en sangre periférica se puede aplicar para evaluar el estado inmunológico,4-6 e incluso proporciona información importante para la identificación de diferentes padecimientos.7,8 De igual forma, se ha demostrado que proporciona datos con valor pronóstico en cáncer gástrico9 y el síndrome de inmuno-deficiencia adquirida (SIDA);10 en esta última enfermedad se ha comprobado que el monitoreo de las subpoblaciones linfoides, específicamente el conteo absoluto de linfocitos CD4, tiene tanto valor pronóstico como terapéutico.11
En la actualidad todo trabajo relacionado con el control evolutivo de los infectados y ensayos clínicos de nuevas drogas, conlleva obligatoriamente la cuantificación de los linfocitos T CD4 +, el descenso del número absoluto de éstos está considerado como uno de los más potentes marcadores predictivos de evolución a SIDA, tanto en pacientes tratados como no tratados.11
En la mayoría de los laboratorios, el método estándar para la determinación del nivel de linfocitos T CD4 +, es la citometría de flujo. Entre sus ventajas se encuentran: exactitud, precisión, rapidez y capacidad para procesar un gran número de muestras en corto tiempo;12 tiene el inconveniente de que el equipo, su mantenimiento y reactivos son muy costosos. Disponer de AcMs conjugados, producidos en nuestro país, con la calidad requerida para este tipo de estudio, hace más económico el diagnóstico y lo garantiza para todos los pacientes VIH/SIDA, así como para el resto de la población de pacientes inmuno-comprometidos.
En el presente trabajo se evaluaron los AcMs conjugados con isotiocianato de fluorescencia (Fict), producidos por el CIM (CIMAB SA, La Habana, Cuba), frente a sus similares de la casa comercial DAKO AG (Dinamarca) y su correlación en cuanto a porcentaje de reconocimiento.
Las muestras se prepararon por el método de marcaje de sangre completa y lisis de eritrocitos. El proceso se realizó a temperatura ambiente y en la oscuridad. Se utilizó el siguiente procedimiento que se describe brevemente: en tubos Falcon de 12 x 75 mm, se agregaron 10 m L de los diferentes AcMs de ambas casas comerciales y 100 mL de sangre total, se incubaron durante 20 min. Posteriormente se agregaron 2 mL de solución de lisis, se incubaron durante 10 min e inmediatamente después se centrifugaron a 300 x g durante 7 min. Se retiró el sobrenadante y el botón de células se resuspendió en 2 mL de solución balanceada de fosfato salino con formaldehído al 1 %, se centrifugó a 300 x g durante 7 min y este lavado se repitió una vez más en iguales condiciones. Los tubos se guardaron en la oscuridad a baja temperatura (4-8 °C) hasta su análisis en el citómetro, que se realizó dentro de las 3 horas siguientes.
Los resultados se analizaron en gráficos de puntos (citogramas); se observó el porcentaje de células positivas para cada caso y para cada AcM usado; en cada muestra se comprobó que se cumplieran los criterios de calidad requeridos para todos los casos, entre los que están: la pureza de la región de linfocitos, que fue mayor del 90 %; el porcentaje de recuperación de linfocitos, también mayor del 90 %; y finalmente se consideró que fueran analizados como mínimo 2 000 linfocitos. En cada experimento se incluyó un sujeto supuestamente normal, para verificar el ajuste de los detectores y comprobar la discriminación adecuada de la fluorescencia empleada.
| | | ||||
| ]]> Cd3 Dako | | | | | |
X | | | | | | ]]> 55,3 |
DE | | | | | | |
CV | | | | ]]> 0,74 | | |
p | | | |
En la tabla 2 se puede observar el coeficiente de correlación lineal de Pearson para cada uno de los AcMs empleados en el estudio.
AcMs | | |
ior T3-Fict Dako anti Cd3 | | |
ior T4-Fict Dako anti Cd4 | | |
T8-Fict Dako anti Cd8 | | |
En ambas tablas se reflejan los resultados de pacientes y controles, independientemente de que el empleo de estos últimos fue dirigido fundamentalmente a garantizar el control de calidad de las mediciones realizadas en el citómetro de flujo.
Con este trabajo se ha demostrado la calidad de los acms-fict producidos en cuba por el centro de inmunología molecular, por lo que se concluyó que se pueden utilizar en el diagnóstico y monitoreo de las subpoblaciones linfoides t cd4 + y cd8 +, con un ahorro considerable al país de moneda libremente convertible y que pueden utilizarse no sólo para el caso de las personas infectadas por el vih, sino también en otras alteraciones en que se requiera una evaluación del estado inmunológico del paciente.
Subject headings: FLOW CYTOMETRY; LABORATORY TECHNIQUES AND PROCEDURES; HIV INFECTIONS.
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2. Hannet I, Erkeller Yuksel F, Lydyard P, Deneys V, DeBruyere M. Development and malnutricional changes in human blood lymphocyte subpopulation. Immunol Today 1992;13(6):215-8.
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4. Deenitchina SS, Ando T, Okuda S, Kinukawa N, Hirakata H, Nagashmina A, et al. Cellular immunity in hemodialysis patients: a quantitative analysis of immune cell subsets by flow cytometry. Am J Nephrol 1995;15(1):57-65.
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Lic. Liliana Pérez Toledo. Laboratorio de Diagnóstico. Subdirección de Atención Médica. Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí" (IPK). Autopista Novia del Mediodía Km 6, La Lisa. Ciudad de La Habana, Cuba. Teléf: (537)220634. Fax: (537) 246051 y 220633. e mail:iperez@ipk.sld.cu
1 Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí".
2 Centro de Inmunología Molecular. ]]>