Revista Cubana de Medicina Tropical, enero-junio, 1995

Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí"

Utilización del ELISA y el ultramicroELISA en la identificación de una cepa de Coxsackie A9 aislada durante la epidemia de neuropatía en Cuba

Dr. ANGEL BALMASEDA,<1 Lic. JOSE LAFERTE,<2 Lic. MARITZA SOLER,2 Lic. SUSANA VAZQUEZ,2 Dra. LICEL RODRIGUEZ,1 Lic. ANSELMO OTERO<3 y Lic. VALEXIS VAZQUEZ2

RESUMEN

Durante 1993, nuestro país se vio afectado por un brote de neuropatía epidémica (NE) caracterizado por 2 formas clínicas fundamentales: óptica y periférica. Aunque la causa de la enfermedad fue considerada multifactorial (fundamentalmente agentes neurotóxicos y deficiencia nutricional), fue aislado un Enterovirus del líquido cefalorraquídeo de un paciente (cepa 47/93, IPK), el cual fue posteriormente clasificado como Coxsackie A9 (Cox A9) mediante la prueba de neutralización (Nt) utilizando los pools de suero de Lim Benyesh Melnick (LBM). Se presentan los resultados obtenidos durante la aplicación del ELISA y del ultramicroELISA en la identificación de este agente a partir del sobrenadante de cultivo de células infectadas, así como en la detección de anticuerpos a la cepa en poblaciones con baja y alta incidencias de la enfermedad.

Palabras clave: NEURITIS/líquido cefalorraquídeo; NEURITIS OPTICA/líquido cefalorraquídeo; VIRUS COXSACKIE A/aislamiento & purificación; TEST DE NEUTRALIZACION; ELISA/métodos.

INTRODUCCION

Los Enterovirus son agentes causales de una amplia gama de enfermedades, los cuales pueden cursar desde una infección subclínica hasta una enfermedad fatal.1,2 El diagnóstico de laboratorio de la infección se basa en el aislamiento e identificación del virus y en la demostración de un aumento significativo del título de anticuerpos séricos mediante la técnica de neutralización.2

Desde hace algunos años se está utilizando la técnica del ELISA para el diagnóstico de algunas infecciones causadas por Enterovirus, se obtienen resultados con altas sensibilidad y especificidad.1-3

Las técnicas de ultramicroELISA (UMELISA) y el sistema SUMA han sido aplicados en nuestro laboratorio para el diagnóstico de diferentes enfermedades infecciosas, lo que significa no sólo un ahorro de reactivos y tiempo sino, además, un incremento de la sensibilidad debido al uso de un sustrato fluorigénico.4-7

Teniendo en cuenta que durante la epidemia de neuropatía se aisló un virus Coxsackie A9 del líquido cefalorraquídeo (LCR) de un paciente,8 nos propusimos aplicar las técnicas de ELISA y UMELISA tanto para la identificación rápida de este agente en el sobrenadante de cultivo de células infectadas, así como para la detección de anticuerpos totales a éste en muestras de suero de poblaciones con alta y baja incidencias de la enfermedad, con el objetivo de determinar el patrón de circulación del virus.

MATERIAL Y METODO

Antígeno. Frascos Roux con células Vero fueron infectados con la cepa 47/93, IPK; cuando el efecto citopático (ECP) fue del 100 % el medio se sometió a 3 ciclos de congelación-descongelación y posteriormente se centrifugó a 2 000 r.p.m. durante 20 minutos. El sobrenadante fue recuperado y almacenado a -70 oC hasta su uso.

Virus. Se evaluaron 25 cepas de Enterovirus las cuales fueron donadas por el Laboratorio Nacional de Referencia de Enterovirus (LNRE) del Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí" (IPK) de Cuba. Siete de ellas habían sido previamente clasificadas como Cox A9.

La cepa M2 del virus de la hepatitis A (VHA) aislada en Cuba,9 fue donada por el Laboratorio Nacional de Referencia de Hepatitis Viral del IPK.

Obtención de la IgG anticepa 47/93, IPK. Fueron donados por el LNRE 20 mL de un suero de conejo con un título de anticuerpos neutralizantes a la cepa 47 de 1:16 000. La fracción gamma de este antisuero fue obtenida por precipitación salina y la IgG mediante cromatografía de intercambio iónico. La concentración de proteína de la IgG purificada (13 mg/mL) fue estimada por el método de Lowry.10

Sueros hiperinmunes. Para evaluar la especificidad de los ensayos serológicos, se utilizaron 7 sueros hiperinmunes a diferentes Enterovirus (sueros a los 6 serotipos de Coxsackie B y 1 a la cepa 47).

Muestras de sueros. Se evaluó un total de 2 767 muestras de sueros las cuales fueron divididas en los siguientes grupos:

Grupo I: 165 muestras de sueros procedentes de pacientes con NE y 250 sueros de contactos de estos pacientes.

Grupo II: 1 345 muestras de sueros de individuos procedentes de zonas de baja incidencia de la enfermedad.

Grupo III: 1 007 muestras de sueros de individuos procedentes de zonas de alta incidencia de la enfermedad.

Sueros controles de referencia. Se utilizó como control positivo para ambos ensayos (ELISA y UMELISA) el suero de un paciente con un título de anticuerpos neutralizantes a la cepa 47 superior a 1/320. Como control negativo se utilizó un pool de suero humano con un título de anticuerpos neutralizantes a esta cepa inferior a 1/10.

Como técnica de referencia para detectar anticuerpos a la cepa 47 se utilizó la prueba de neutralización (Nt), la cual fue realizada por la técnica del micrométodo.2

Inmunoensayos. Se utilizaron 2 procedimientos, ELISA Y UMELISA. Fue aplicado el método sandwich para la identificación rápida de cepas de Cox A9 a partir de sobrenadante de cultivo de células infectadas. El método de inhibición fue empleado para la detección de anticuerpos a la cepa 47.

INMUNOENSAYOS PARA LA IDENTIFICACION DE LAS CEPAS COX A9

ELISA. Se utilizaron placas de cloruro de polivinilo (PVC), las cuales fueron sensibilizadas con 100 mL/pozo de una solución de IgG anticepa 47 a una concentración de 10 mg/mL en buffer carbonato-bicarbonato, pH 9,6. La incubación se realizó durante 18 horas a temperatura ambiente en cámara húmeda.

Posterior a todas las incubaciones las placas fueron lavadas 3 veces con una solución de PBS, pH 7,4; conteniendo 0,05 % de Tween-20 (PBS-T).

Se adicionaron 100 mL/pozo del sobrenadante obtenido de la inoculación de las diferentes cepas virales y las placas fueron incubadas a 37 oC durante 1 hora. Después del lavado se añadieron 100 mL/pozo de la IgG anticepa 47 conjugada a la enzima peroxidasa del rábano picante (Sigma, Tipo VI), diluida 1/1 000 en PBS-T conteniendo 5 % de suero de ternera (PBS-T/ST). Después de 1 hora de incubación se adicionaron 100mL/pozo del sustrato, compuesto por ortofenilendiamina (OPD) 1mg/mL y 0,4 mL/mL de H202 diluidos ambos en buffer fosfatocitrato, pH 5. La reacción fue detenida después de 30 minutos a temperatura ambiente con 100 mL/pozo de H2SO4 al 12,5 %. La lectura se realizó en un lector de ELISA a una longitud de onda de 492 nm. Las muestras con densidades ópticas (DO) superiores a 0,21 fueron consideradas positivas.

UMELISA. Se utilizaron ultramicroplacas de poliestireno de 96 pozos (SUMA), las cuales fueron recubiertas con 10 mL/pozo de IgG anti 47 (10 mL/mL) diluidas en buffer carbonato-bicarbonato, pH 9,6.

Posterior a cada tiempo de incubación, las placas fueron lavadas 4 veces con PBS-T, se añadieron 10mL/pozo de cada cepa viral y se incubaron durante 1 hora a 37 oC. Posterior al lavado se adicionaron 10 mL/pozo de la IgG anti 47 conjugada a la enzima fosfatasa alcalina diluida 1/2 000 en PBS-T/ST; después de 1 hora de incubación a 37 oC se añadieron 10mL/pozo del sustrato fluorigénico correspondiente a la fosfatasa alcalina (4 metil lumberiferil fosfato) a una concentración de 0,13 mg/mL en buffer dietanolamina pH 9,8; y se incubaron 30 minutos a temperatura ambiente. La fluorescencia (F) resultante fue estimada en un equipo SUMA modelo 321. Una lectura mayor de 20 unidades de fluorescencia fue considerada positiva.

INMUNOENSAYOS PARA LA DETECCION DE ANTICUERPOS A LA CEPA 47

ELISA de inhibición. Las placas fueron recubiertas del mismo modo que en el ensayo sandwich, posteriormente se añadió una mezcla de 50 mL de las muestras previamente diluida 1/20 en PBS-T/ST y 100 mL de antígeno. Los pasos siguientes se realizaron de la misma forma que en el ensayo de sandwich. En cada serie de determinaciones se incluyó un suero positivo y negativo de referencia. Los resultados fueron transformados utilizando la siguiente expresión:

Inhibición (%)=1 - (DO muestra/DO control negativo) x 100

Las muestras con porcentajes de inhibición superiores a 45, fueron consideradas positivas.

UMELISA de inhibición. Las placas fueron recubiertas del mismo modo que en el ensayo sandwich, posteriormente se añadió una mezcla de 5 mL de las muestras previamente diluida 1/20 en PBS-T/ST y 10 mL de antígeno, los pasos siguientes fueron idénticos al ensayo sandwich. En cada serie de determinaciones se incluyó un suero positivo y negativo de referencia. Los resultados fueron transformados utilizando la siguiente expresión:

Inhibición (%)=100 - (F muestra/F control negativo) x 100

Las muestras con porcentajes de inhibición superiores a 70, fueron consideradas positivas.

ANALISIS ESTADISTICO

La especificidad, sensibilidad y el porcentaje de coincidencia con el método de referencia fueron calculados según Griner et al., 1981.11 Se utilizó un análisis de chi-cuadrado para determinar las diferencias significativas entre los grupos II y III.

RESULTADOS

La concentración de los reactivos y las condiciones de reacción para ambos ensayos (ELISA y UMELISA) fueron determinadas mediante titulación cruzada, se seleccionaron aquéllas que ofrecieron una adecuada discriminación entre los sueros controles de referencia utilizados.

IDENTIFICACION DE LAS CEPAS COX A9

La tabla 1 muestra los resultados obtenidos cuando se evaluaron en ELISA y UMELISA 26 muestras de sobrenadante de cultivo de células infectadas con diferentes Enterovirus, incluyendo 1 infectado con el virus de la hepatitis A. Sólo las cepas de Cox A9 aisladas antes y durante la epidemia de neuropatía, incluyendo la cepa 47/93, IPK, mostraron respuestas (DO o fluorescencia) superiores al valor de corte establecido para cada ensayo.

DETECCION DE ANTICUERPOS A LA CEPA 47

El ELISA y la Nt fueron comparados utilizando 415 sueros del Grupo I, se obtuvieron una sensibilidad del 95,1 %, una especificidad del 87,3 y una coincidencia del 93,7 (tabla 2).

La tabla 3 muestra los resultados obtenidos cuando se compararon el ELISA y el UMELISA utilizando 336 muestras de suero procedentes del Grupo III, las cuales pertenecían a una zona de Ciudad de La Habana, controlada clínica y epidemiológicamente por la elevada incidencia de la enfermedad. El UMELISA presentó una sensibilidad del 99,6 %, una especificidad del 88,0 y una coincidencia del 97,3.

El estudio serológico de diferentes poblaciones con alta y baja incidencias de la enfermedad se realizó mediante el ELISA de inhibición (tabla 4). Aunque se detectó una seropositividad superior al 60 % para cada población estudiada, se observó una diferencia estadísticamente significativa (p < 0,05) entre éstas.

DISCUSION

DETECCION DE ANTIGENO

El ELISA tipo sandwich ha sido de utilidad en la identificación de diferentes Enterovirus, muestra ventajas sobre otros métodos inmunoenzimáticos utilizados para este propósito.12

En este trabajo se reporta el uso de 2 sistemas inmunoenzimáticos tipo sandwich (ELISA y UMELISA), para la identificación de cepas de Cox A9 aisladas antes y durante el brote de NE, a partir de sobrenadante de cultivo de células infectadas. Ambos ensayos resultaron altamente específicos, se pudieron identificar la cepa 47 y otros aislamientos clasificados como Cox A9 (incluyendo la cepa de referencia), del resto de los Enterovirus evaluados (tabla 1).

Aunque estos métodos no sustituyen a la técnica de Nt, sí constituyen una rápida alternativa para la identificación de Cox A9 a partir de cultivo de células infectadas, ya que los resultados pueden ser obtenidos en un tiempo de 3 horas, facilitándose además la interpretación de éstos.

Estudios posteriores podrían estar dirigidos a evaluar a la sensibilidad de dichos métodos utilizando muestras de líquido cefalorraquídeo (LCR).

ESTUDIOS SEROLOGICOS

La especificidad de los ensayos serológicos fue corroborada mediante la evaluación de 7 sueros hiperinmunes a diferentes Enterovirus. Sólo el suero hiperinmune a la cepa 47 mostró un tanto por ciento de inhibición superior al valor de corte establecido para cada ensayo (datos no presentados).

Los resultados obtenidos al comparar el ELISA y la prueba de Nt, mostraron una mejor concordancia entre los resultados que los previamente reportados para los virus Coxsackie.1,13 En nuestro caso el ELISA mostró ser tan específico como la Nt en la detección de anticuerpos a la cepa 47, se obtuvieron sólo 30 sueros discordantes, cuyos valores se distribuyeron cercanos al valor de corte establecido para el ELISA. Estos resultados respaldan la utilización del ELISA como un método confiable para la realización de estudios de seroprevalencia en relación con el virus Cox A9.

En este trabajo se obtuvo una adecuada coincidencia entre los resultados al comparar los métodos de ELISA y UMELISA de inhibición. Se obtuvieron sólo 9 sueros discordantes, los cuales se distribuyeron alrededor del valor de corte de ambos ensayos (tabla 3). Los 8 sueros UMELISA positivos, ELISA negativos, resultaron negativos en la prueba de Nt. Estos resultados podrían ser debidos a falsos positivos de la prueba UMELISA o a una mayor sensibilidad de este método debido a la utilización de un sustrato fluorescente, lo cual ha sido reportado por otros autores.3,14,15

El estudio serológico realizado a las poblaciones de baja y alta incidencias de NE, mediante la técnica de ELISA de inhibición, detectó una elevada prevalencia de anticuerpos a la cepa 47, y se observó una diferencia estadísticamente significativa entre las respuestas de ambas poblaciones. Estos resultados confirman la hipótesis de que estaba ocurriendo una mayor circulación de este agente entre los individuos con mayor incidencia de NE.

La causa de la NE no ha sido aún esclarecida, se plantean de forma fundamental factores de índole tóxico-nutricional. Sin embargo, el aislamiento e identificación de un agente viral en el LCR de pacientes con esta enfermedad, así como los diferentes estudios serológicos, que demostraron un aumento progresivo de la circulación del agente aislado en nuestra población,16 constituyen hallazgos virológicos que deben ser tomados en consideración cuando se trata de explicar la causa de la NE.

Los resultados obtenidos mediante la aplicación de los métodos inmunoenzimáticos complementan los hallazgos virológicos antes mencionados y apoyan la necesidad de enfocar las causas de la epidemia de neuropatía desde un punto de vista multifactorial.

AGRADECIMIENTOS

Agradecemos a la UNESCO por haber colaborado en parte con el financiamiento para la realización de esta investigación.

<1Especialista de I Grado en Microbiología.
<2Licenciado en Bioquímica.
<3Doctor en Ciencias Biológicas.

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Recibido: 17 de noviembre de 1994. Aprobado: 2 de febrero de 1995.

Dr. Angel Balmaseda. Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí". Apartado 601, Marianao 13, Ciudad de La Habana, Cuba.