Instituto Superior de Ciencias Médicas de La Habana

Inmunorreacción de los anticuerpos monoclonales A3, E1 y P3 en tejido normal

Dra. Mayra A. Gari Calzada, Lic. María D. Dujarric Hart, Dra. Violeida Sánchez Socarrás, Lic. Mercedes Cedeño Arias, Dr. Enrique Rengifo Calzado y Dra. Teresita Rodríguez Obaya

RESUMEN

Conocer el reconocimiento tisular en órganos normales de estos anticuerpos monoclonales (AcMs) dirigidos contra moléculas de gangliósidos es importante como parte de su evaluación para uso diagnóstico. Las muestras fueron procesadas frescas y posteriormente fijadas en paraformaldehído. Los 3 sobrenadantes de cultivo se trabajaron puros y en todos los experimentos se utilizaron controles negativos y positivos. Los 3 AcMs reaccionaron con células del epitelio intestinal y el tejido conectivo de la submucosa. Los antígenos A3 y E1 se localizaron también en el epitelio traqueobronquial. El AcM E1 reaccionó con los epitelios renal y prostático mientras que el A3 lo hizo en la epidermis y los ganglios autónomos mientéricos. La inmunotinción de las secreciones renales e intestinales con estos AcMs junto a las características del marcaje tisular pudieran sugerir la naturaleza monosacarídica de estos antígenos.

Descriptores DeCS: ANTICUERPOS MONOCLONALES/inmunología; GANGLIOSIDOS/inmunología; REACCIONES ANTIGENO-ANTICUERPO; CULTIVO DE TEJIDO; MOLECULAS DE ADHESION CELULAR/inmunología; EPITOPES; ADHERENCIA CELULAR/inmunología.

El término ganglíoidos fue introducido por Klenk en 1942 para designar unos lípidos del sistema nervioso con localización predominante en células ganglionares y en cuya composición hay una molécula de ceramida anclada en la membrana celular y diferentes monosacáridos, entre los que está el ácido siálico, hacia el comportamiento extracelular.^1,2

Estos glicolípidos complejos se encuentran en la superficie externa de la mayoría de las membranas celulares y forman parte de la identidad inmunológica de las células de mamíferos. Estas moléculas participan en diversos tipos de señalización celular en procesos tales como proliferación, diferenciación, migración y apoptosis.^3,4 La transducción de la señal de los factores de crecimiento epidérmico y plaquetario que se acompaña de fosforilación proteica, es modulada por los gangliósidos GM3 y GM1, respectivamente.⁵

Se conoce que el perfil carbohidratídico de la superficie celular cambia no sólo durante el desarrollo normal sino también en los desórdenes del comportamiento celular que se asocian a procesos tumorales.^5,6 Las modificaciones en la composición gangliosídica de las células tumorales pueden ser la causa de algunas interacciones anormales entre dichas células y su ambiente. Algunos gangliósidos se independizan de las células tumorales y pueden modificar la inmunidad del hospedero, contribuyendo de este modo al desarrollo del tumor.⁶ Hay evidencias crecientes de que los gangliósidos desempeñan su papel en el crecimiento tumoral, progresión y metástasis.⁷

Numerosos investigadores en la búsqueda de posibles marcadores para el diagnóstico y pronóstico del cáncer han comparado las concentraciones de gangliósidos del tejido tumoral con las de sus homólogos normales y las mismas se encontraron incrementadas a favor de los primeros.^8-10

El propósito del presente trabajo es conocer el reconocimiento tisular de 3 anticuerpos monoclonales (AcMs) dirigidos contra moléculas de gangliósidos, como parte del estudio de sus posibilidades diagnósticas y/o terapéuticas.

MÉTODOS

Muestras de tejidos normales del adulto se obtuvieron en el transcurso de la hora siguiente al retiro del soporte vital después de confirmado el diagnóstico de muerte encefálica. El consentimiento informado del donante (cuño en el carnet de identidad) fue ratificado por la familia.

Los fragmentos fueron congelados en nitrógeno líquido y posteriormente conservados a -70 °C. Se realizaron cortes de 4 m en un criostato y se desarrollaron 2 protocolos de fijación con paraformaldehído, después de cortar y antes del experimento, hasta encontrar la mejor preservación del tejido con la menor afectación antigénica. Los tejidos fueron fijados en paraformaldehído durante 2 min antes de realizar el experimento.

El ajuste del tiempo de incubación y de la concentración en la que los 3 sobrenadantes de cultivo alcanzan el mejor contraste entre el reconocimiento específico y el fondo (background) fueron realizados en cerebro fetal para los AcMs A3 y E1 y en tumor de mama para el P3. Los sobrenadantes se trabajaron puros y se incubaron durante 2 h. El sistema de detección empleado fue el complejo avidina-biotina peroxidasa (Vectastain, CA) y el cromógeno aminoetilcarbazol. Los tiempos de incubación tanto para el anti-ratón biotinilado como para el complejo fueron de 1h.

El control positivo para cada experimento fueron cortes de piel a los que se les aplicó el AcM ior/r3egf (CIMAB,S.A.) mientras que para el negativo en un espécimen de cada muestra la primera incubación se realizó con tris salino al 1 % en lugar del AcM primario. Cortes de tejido nervioso y cáncer de mama sirvieron de controles positivos para los sobrenadantes.

ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS

En todos los tejidos donde se observó inmunotinción (tabla) las intensidades oscilaron entre leve a moderada y el reconocimiento tisular no fue homogéneo.

TABLA. Localización e intensidad de la inmunorreacción

Tejidos	A3	E1	P3
Estómago	2(3) +submucosa	2(3)	0(3)+submucosa
Intestino delgado	3(3) ++epitelio  ++submucosa	3(3) ++epitelio	3(3) +epitelio
	3(3) ++submucosa	3(3) ++submucosa  +++ganglios
Intestino grueso	2(3)  ++epitelio  ++submucosa	2(3) ++epitelio  ++submucosa	2(3) +epitelio  ++submucosa
Pulmón	2(4) +tejido conectivo  +epitelio bronquios	2(4) +tejido conectivo  +epitelio bronquios	2(4) +tejido conectivo
Tráquea	1(1) +epitelio	1(1) +epitelio	1(1) +tejido conectivo
Riñón	1(1) ++secreciones tubulares  ++secreciones	1(1) +epitelio túbulos	0(1)
Piel y epitelio glandular	1(2) ++melanocitos	0(2)	0(2)
Hígado	0(2)	1(2) +pared vaso	0(2)
Próstata	0(1)	1(1) ++epitelio	0(1)
Téstículo	0(1)	0(1)	0(1)
Útero	0(1)	0(1)	0(1)
Ovario	0(1)	0(1)	0(1)
Adrenales	0(3)	0(3)	0(3)
Corazón	0(4)	0(4)	0(4)
Músculo esquelético	0(3)	0(3)	0(3)
Bazo	0(2)	0(2)	0(2)
Páncreas	0(1)	0(1)	0(1)
Vejiga	0(1)	0(1)	0(1)

Leyenda: +leve ++moderada +++intensa. 2(3): 2 positivos de 3 estudiados

Ando (1983) al estudiar la presencia de gangliósidos en el sistema nervioso reportó que estas moléculas no están distribuidas de manera uniforme en la superficie celular sino formando acúmulos (clusters) que rodean a las proteínas ancladas en la membrana.² La homogeneidad del marcaje de los melanocitos de la piel (figura 1) y de los ganglios autónomos del intestino delgado con el AcM A3, pudiera ser compatible con una distribución más uniforme del antígeno reconocido por este anticuerpo en estos tejidos.

FIGURA 1. Inmunotinción de los melanocitos con el AcM A3.Los 3 AcMs reaccionaron con células del epitelio intestinal (figura 2) y con el tejido conectivo de la submucosa. Este reconocimiento específico del tejido conectivo pudiera interpretarse por la presencia de cadenas polisacarídicas llamadas glicosaminoglicanos (GAGs) en la matríz extracelular. En estos GAGs hay residuos repetitivos del aminoazúcar N-acetilgalactosamina también presente en algunos gangliósidos.¹¹ FIGURA 2. Inmunotinción del epitelio del colon con el AcM E1.Las inmunotinciones de los epitelios de la tráquea, bronquios y el estómago, así como de las secreciones del intestino grueso y tubuli renales con los AcMs A3 y E1 refuerzan la hipótesis de la naturaleza monosacarídica de estos antígenos. El antígeno E1 también se localizó en los epitelios prostático y tubular del riñón.

La imposibilidad de conseguir muestras frescas de tejido nervioso por razones éticas, nos han impedido buscar la presencia de los antígenos A3, E1 y P3 en este tejido. Hay reportes que confirman, por cromatografía de capa fina, la presencia de gangliósidos en tejidos y las mayores concentraciones se reportan en el nervioso (>10 %) mientras que en otros tales como hígado, bazo y riñón se estima sean inferiores a 5 %.^10,12

La ausencia de inmunorreacción en algunos tejidos (tabla) puede ser interpretada como no presencia de los antígenos en dichos tejidos pero también ser resultado de concentraciones que estén por debajo del límite de resolución de esta técnica, lo que hace imposible la visualización de la reacción.

CONCLUSIONES

1. Los 3 anticuerpos reconocen antígenos tisulares en tejido fresco.

2. Los antígenos E1 y A3 tienen una localización preferentemente epitelial.

3. El antígeno P3 es muy escaso o pudiera estar ausente en casi todos los tejidos estudiados.

SUMMARY

To know the tissue recognition in normal organs of these monoclonal antibodies directed against gangliosides molecules is important as part of their evaluation for diagnostic use. The fresh samples were processed and later fixed in paraformaldehyde. The 3 supernadants of culture were purely worked and negative and positive controls were used in all the experiments. The 3 monoclonal antibodies reacted to cells from the intestinal epithelium and from the connective tissue of the submucosa. A3 and E1 Antigens were also located in the tracheobronchial epithelium. The monoclonal antibody E1 reacted to the renal and prostatic epithelial, whereas the A3 did it in the epidermis and the myenteric autonomous ganglia. The immunostaining of the renal and intestinal secretions with these monoclonal antibodies together with the characteristics of the tissue marking may suggest the monosaccharic nature of these antigens.

Subject headings: ANTIBODIES, MONOCLONAL/immunology; GANGLIOSIDES/ immunology; ANTIGEN-ANTIBODY REACTIONS; TISSUE CULTURE; CELL ADHESION MOLECULES/ /immunology; EPITOPES; CELL ADHESION/immunology.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Wiegandt H. The chemical constitution of gangliosides of the vertebrate nervous system. Behav Brain Res 1995;66:85-97.
2. Ando S. Gangliosides in the nervous system. Neurochem Int 1983;5:507-37.
3. Sharon N, Lis H. Carbohidratos en el reconocimiento celular. Invest Cienc 1993;198:20-7.
4. Bernhard H, Roth S, Bauerschmit J, Meyer K, Dippold W. Immunorecognition of different gangliosides epitopes on human normal and melanoma tissues. Int J Cancer 1992;51:568-72.
5. Nagai Y. Functional roles of gangliosides in bio-signaling. Behav Brain Res 1995;66:99-104.
6. Dumontet C, Portovkalian J. Gangliosides and cancer. Bull Cancer (Paris) 1991;78:789-99.
7. Wikstrand C, Longee D, McLendon R, Fuller G, Friedman H, Fredman P, et al. Lactotetraose series ganglioside 3,6-isoLD1 in tumors of central nervous and other systems in vitro and in vivo. Cancer Res 1993;53:120-6.
8. Mennel H, Bosslet K, Wiegand H, Sedlacek H, Baver B, Rodden A. Expression of GD2 epitopes in human intracranial tumors and normal brain. Exp Toxicol Pathol 1992;44:317-24.
9. Nakakuma H, Horikawa K, Kawaguchi T. Common phenotypic expression of gangliosides GM3 and GD3 in normal human tissues and skin lesions. Jpn J Clin Oncol 1992;22:308-12.
10. Diattovitskaia E, Tekeieva E, Lemenovskaia A, Somova O, Bergel L. Gangliosides GM3 and GD3 in human stomach and breast tumors. Biothimiia 1991;56:560-4.
11. Alberts B, Bray D, Lewis J, Raff M, Roberts K, Watson J. Cell-cell adhesion and extracellular matrix. En: Molecular biology of the cell. New York: Garland, 1983:673-715.
12. Svennerholm L, Rynmark B, Vilbergsson G, Fredman P, Gottfries J, Mansson J, et al. Gangliosides in human fetal brain. J Neurochem 1991;56:1763-8.

Recibido: 29 de enero de 1997. Aprobado: 15 de febrero de 1997.

Dra. Mayra A. Gari Calzada. Masó 380, apartamento 2, entre Pedro Pérez y General Suárez, municipio Cerro, Ciudad de La Habana, Cuba.